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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » takara的T4 连接酶要连多久呀。。
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草哥cium

新虫 (正式写手)

[求助] takara的T4 连接酶要连多久呀。。 已有1人参与

在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind Ⅲ的分解物在 16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（unit）。
T4 DNA Ligase (350 U/μl)
那大家觉得10ug的和10ug的质粒要连多久。。。是不是几分钟就好了。。

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1楼 2018-06-22 15:02:09
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
过夜连
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2楼2018-06-22 15:12:14
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草哥cium

新虫 (正式写手)


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3楼2018-06-22 15:17:10
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du20131580

金虫 (正式写手)
看你片段多大呀，长片段最好过夜哦

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4楼2018-06-22 15:23:59
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草哥cium

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by du20131580 at 2018-06-22 15:23:59
看你片段多大呀，长片段最好过夜哦

549bp   捏

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5楼2018-06-22 15:34:23
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du20131580

金虫 (正式写手)
★
渊博震天: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-06-22 16:58:51
这个还好，不是很长。为了连接转化效率，建议还是16℃过夜连比较好。

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6楼2018-06-22 16:04:49
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Wang-Daryl

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
渊博震天: 金币+5, 鼓励有价值的回帖 2018-06-22 17:17:48
草哥cium(渊博震天代发): 金币+2, 回帖积极有用 2018-06-23 13:54:45
首先，根据你买的T4连接酶来确定一下连接体系，之后通过Nanodrop来测定一下目的片段和质粒浓度，根据说明书要求合理设置摩尔比，一般T4连接酶就是16℃过夜。如果是用无缝克隆的话就很快，但是引物设计要有同源臂。
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7楼2018-06-22 17:16:59
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呆呆的小羊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by du20131580 at 2018-06-22 16:04:49
这个还好，不是很长。为了连接转化效率，建议还是16℃过夜连比较好。

你好，请问下6000的质粒片段和500的目的片段过夜连接的话大概多长时间
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8楼2018-07-31 11:11:55
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Agonilb

新虫 (小有名气)
过夜

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9楼2018-07-31 12:32:17
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nineshow1

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Wang-Daryl at 2018-06-22 17:16:59
首先，根据你买的T4连接酶来确定一下连接体系，之后通过Nanodrop来测定一下目的片段和质粒浓度，根据说明书要求合理设置摩尔比，一般T4连接酶就是16℃过夜。如果是用无缝克隆的话就很快，但是引物设计要有同源臂。

现在谁还用过夜连接的连接酶 都是10分钟的快速连接酶

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2018-11-17 21:10:32
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