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最近在构建一批质粒，通过双酶切的方式在目的载体上插入400bp左右的PCR产物。之前一直做得好好的。后来发现连接转化后长的克隆慢慢的在变少，由原来的200-300个克隆一点点的变成100个，50个，20个，再后来变成1-2个，现在直接不长克隆了。 按照分子生物学实验一旦做不出来就全部换新的原则。我拿了新的未开封的限制性内切酶，T4连接酶，换了新买的氨苄和新买的感受态。然而还是没有长克隆。但我拿着之前构建好的质粒做对照，把质粒稀释到0.08ng还能长100-200个克隆。 接着我把两个限制性内切酶分别单酶切，发现都能切开。单酶切产物切胶回收，用T4连接酶连接后做转化，也能长出100-200个克隆。然而双酶切就是不长克隆。 做了十年的分子生物学实验，结果遇到了这种不科学的事情。哪位大神知道哪出了问题？  @biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
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