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原创首发:Tips for Western Blot-一些小技巧而已已有7人参与
大部分是自己实验中发现和使用的,也有其他人的经验方法,一并总结进来,谢谢支持。我用的湿转,PVDF膜,0.22,部分tips有局限性,酌情使用。
1、转膜后,有时需要确定两道样品的间隙,以便从中裁开分别敷抗体。
最简单的方法是:转膜完毕,稍用力挤干转移缓冲液,镊子夹起膜的一角,轻轻风干(我会吹口气加速),在半干不干的时候正面会显示出蛋白的柱状痕迹,因为结合了蛋白的地方干的慢,间隙干的快先变白。
如果动作快,裁完直接泡TBS可以完全浸润,否则需要先泡一下甲醇再封闭。不影响结果。
当然也可以用丽春红染色,不但能显示条带位置,而且可以知道蛋白跑的整不整齐,上样量是否一致。
或者在需要区分的样品间加一道Marker。
2、曝光完成,膜就没用了。但是我会把膜扔到稀释一百倍左右的考马斯亮蓝染色液里。过阵子取出清水冲几遍,晾干,就可以观察到明显的蛋白条带。可以用透明胶粘到实验记录本里做参考。
3、转膜完,剩下的胶也扔到稀释二十倍的考马斯亮蓝染色液里。几个小时后可以直接观察条带。染胶的染液需要比上面染膜的浓一点。
4、我们的PVDF膜是成卷的,50cm宽,经常被裁的长长短短东一块西一块。有时候我会按制胶的梳子齿的宽度预先裁成长条,以后再裁不同宽度下来就行啦。
5、关于分离胶浓度的选择,区分30kd以下的蛋白一般用12~15%的胶,40~80左右的用12%就行,大于90KD的最好用8~6%。
但是,如果不小心配的胶浓度偏低,用小电压小电流慢慢跑,也能凑活用。至于偏高,大不了多跑一会儿,就是要注意防止升温过高。
6、转膜的电流:湿转,我用恒流。40kd左右,180mA 3h, 或者200mA 1h45',效果一致。 大于100kd, 200~250 mA, 2h。 一般分子量越大转膜的电流和时间相应延长就可以。
7、一抗的节省:上次学了用保鲜膜包裹膜和抗体液4度孵育过夜,果然很省。就是不易回收。
为了利于回收,我一般只用TBS稀释一抗。同时为了降低非特异结合,延长封闭时间,4度过夜孵一抗,都是必要的。
8、曝光,第一张片子我习惯同时曝两张。万一背景较强,第一张可以滤去一部分。也防止同时曝光的多种条带,有的太浓有的太淡。
9、新买的抗体,多试几个稀释度还是挺有益处的,分装成小包装保存也利于延长保质期。
10、转完膜不能继续做,可以把膜晾干保存在干净自封袋中。下次用甲醇浸透,TBS洗一下,接着封闭就行了。
暂时想起来这些,欢迎补充。
谢谢回帖~~
祝大家western顺利!
[ Last edited by baisuilan on 2009-7-22 at 13:48 ] |
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