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原创首发：Tips for Western Blot-一些小技巧而已已有7人参与
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大部分是自己实验中发现和使用的，也有其他人的经验方法，一并总结进来，谢谢支持。我用的湿转，PVDF膜，0.22，部分tips有局限性，酌情使用。 1、转膜后，有时需要确定两道样品的间隙，以便从中裁开分别敷抗体。 最简单的方法是：转膜完毕，稍用力挤干转移缓冲液，镊子夹起膜的一角，轻轻风干（我会吹口气加速），在半干不干的时候正面会显示出蛋白的柱状痕迹，因为结合了蛋白的地方干的慢，间隙干的快先变白。 如果动作快，裁完直接泡TBS可以完全浸润，否则需要先泡一下甲醇再封闭。不影响结果。 当然也可以用丽春红染色，不但能显示条带位置，而且可以知道蛋白跑的整不整齐，上样量是否一致。 或者在需要区分的样品间加一道Marker。 2、曝光完成，膜就没用了。但是我会把膜扔到稀释一百倍左右的考马斯亮蓝染色液里。过阵子取出清水冲几遍，晾干，就可以观察到明显的蛋白条带。可以用透明胶粘到实验记录本里做参考。 3、转膜完，剩下的胶也扔到稀释二十倍的考马斯亮蓝染色液里。几个小时后可以直接观察条带。染胶的染液需要比上面染膜的浓一点。 4、我们的PVDF膜是成卷的，50cm宽，经常被裁的长长短短东一块西一块。有时候我会按制胶的梳子齿的宽度预先裁成长条，以后再裁不同宽度下来就行啦。 5、关于分离胶浓度的选择，区分30kd以下的蛋白一般用12~15%的胶，40~80左右的用12%就行，大于90KD的最好用8~6%。 但是，如果不小心配的胶浓度偏低，用小电压小电流慢慢跑，也能凑活用。至于偏高，大不了多跑一会儿，就是要注意防止升温过高。 6、转膜的电流：湿转，我用恒流。40kd左右，180mA 3h， 或者200mA 1h45',效果一致。 大于100kd, 200~250 mA, 2h。 一般分子量越大转膜的电流和时间相应延长就可以。 7、一抗的节省：上次学了用保鲜膜包裹膜和抗体液4度孵育过夜，果然很省。就是不易回收。 为了利于回收，我一般只用TBS稀释一抗。同时为了降低非特异结合，延长封闭时间，4度过夜孵一抗，都是必要的。 8、曝光，第一张片子我习惯同时曝两张。万一背景较强，第一张可以滤去一部分。也防止同时曝光的多种条带，有的太浓有的太淡。 9、新买的抗体，多试几个稀释度还是挺有益处的，分装成小包装保存也利于延长保质期。 10、转完膜不能继续做，可以把膜晾干保存在干净自封袋中。下次用甲醇浸透，TBS洗一下,接着封闭就行了。 暂时想起来这些，欢迎补充。 谢谢回帖~~ 祝大家western顺利！ [ Last edited by baisuilan on 2009-7-22 at 13:48 ] |
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