应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜     石溪大学接受考研调剂申请>

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Red同源重组，大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊？
【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
351/1返回列表
查看: 3340  |  回复: 34
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

寒冬夜寂

新虫 (小有名气)

[交流] Red同源重组，大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊？

萌新最近开始做Red同源重组来敲除大肠杆菌O157(EDL933)中的一个基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20这三个质粒，从DH5a中提取出来就PCR验证了，证明质粒没有问题，现在已经得到了pKD46/O157重组子，下一步就是打靶片段扩增，我的打靶片段是选取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4为模板扩增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖终浓度是30mM，诱导2h，再用10%甘油处理做成电转感受态，电转条件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后离心涂布到Kan抗性平板，设置了阴性对照（电转水）、阳性对照（电转pKD4），打靶片段还用Dpn 1处理了，但是实验组和对照组都没有长。
我怀疑是这样几个原因：
1.电转感受态制备活性不够好
2.打靶片段扩增出现错配（我没有测序，是PCR产物用Dpn 1酶处理再跑胶切胶回收）
3.是不是同源替换片段太长了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，会不会是太长了同源重组难以发生？
4.我师兄说现在第一步就是把阳性对照弄出来，但是阳性对照我看了pKD4和pKD46没有相同的启动子，应该是可以共存的，那就是说明我电转化感受态制备有问题？
5.还有个问题就是我怎么判断pKD46被诱导表达了同源重组酶？
想请教下各位分子大佬，有没有做这方面的经验，能对小弟我指导下，而且网上查还说大肠杆菌K系列什么的容易敲除，这个什么系列是怎么查看的呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2019-12-03 09:46:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

安静de执着14

新虫 (著名写手)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
可能是打靶DNA片段浓度太低，导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度，不用DpnI处理，另外，你的电击电压太大，导致致死率偏高

发自小木虫Android客户端
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2019-12-03 11:53:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biosci

捐助贵宾 (职业作家)
k12大肠菌株就是很好敲除

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2019-12-03 17:27:22
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

寒冬夜寂

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2019-12-03 11:53:27
可能是打靶DNA片段浓度太低，导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度，不用DpnI处理，另外，你的电击电压太大，导致致死率偏高

降低pKD4模板浓度和Dpn 1处理的目的不都是为了减少模板影响的假阳性吗？我pKD4浓度时从DH5a中提取的，没有测量具体浓度
电机电压过高，一般多少合适？
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2019-12-03 19:52:30
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安静de执着14

新虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 寒冬夜寂 at 2019-12-03 19:52:30
降低pKD4模板浓度和Dpn 1处理的目的不都是为了减少模板影响的假阳性吗？我pKD4浓度时从DH5a中提取的，没有测量具体浓度
电机电压过高，一般多少合适？...

你用DpnI处理后，有没有再纯化一下呢？如果再纯化的话，可能会降低打靶DNA的浓度。如果不纯化，可能会影响电击。你试试1.5——1.8KV。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2019-12-03 20:20:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biosci

捐助贵宾 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 寒冬夜寂 at 2019-12-03 19:50:10
想请教一下这个K12是怎么查询的呢？...

k12菌株就是最常见的大肠杆菌原始株，很多其他型号菌株都是这个菌株衍生而来的，比如dh5a

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2019-12-03 22:14:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

85888888

铁虫 (初入文坛)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
你好，请问你最后成功了么？我现在也在做这个，也遇到了这个问题，阳性对照也不长
赞一下(1人) 回复此楼
29楼2021-04-19 10:59:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

寒冬夜寂

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by biosci at 2019-12-03 17:27:22
k12大肠菌株就是很好敲除

想请教一下这个K12是怎么查询的呢？
赞一下 回复此楼
9楼2019-12-03 19:50:10
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

夜来猪叫声

铁虫 (小有名气)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
11楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2019-12-03 20:20:01
你用DpnI处理后，有没有再纯化一下呢？如果再纯化的话，可能会降低打靶DNA的浓度。如果不纯化，可能会影响电击。你试试1.5——1.8KV。
...

请问你之前电转时候片段浓度是多少啊？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
18楼2020-11-14 20:04:58
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

初七初七呐

新虫 (初入文坛)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
请问楼主可以给个联系方式么？最近在做电转一直没敲掉目的基因。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
31楼2021-06-19 09:43:17
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

85888888

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 初七初七呐 at 2021-06-19 09:43:17
请问楼主可以给个联系方式么？最近在做电转一直没敲掉目的基因。

请问你成功了么？我也一直在做的这个，但是都没有成功
赞一下 回复此楼
32楼2021-12-16 13:43:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenhuanlong

新虫 (文学泰斗)
gjgjky

发自小木虫Android客户端
回复此楼
33楼2021-12-17 14:22:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忆江南江南好

新虫 (初入文坛)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
我们可以代做，做不出不收费ts901128@126.com
赞一下 回复此楼
34楼2022-01-13 21:49:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忆江南江南好

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
32楼: Originally posted by 85888888 at 2021-12-16 13:43:11
请问你成功了么？我也一直在做的这个，但是都没有成功...

我们可以代做，做不出不收费ts901128@126.com
赞一下 回复此楼
35楼2022-01-13 21:50:33
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
xiaoqiuqiu202楼
2019-12-03 11:15   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
xiaoshuang14楼
2019-12-03 13:06   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
solarzhao5楼
2019-12-03 13:20   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
hikingman6楼
2019-12-03 13:31   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
biosci7楼
2019-12-03 17:26   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
j 发自小木虫Android客户端
miaojiabing13楼
2019-12-04 08:28   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
psylhh14楼
2019-12-05 20:12   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
nono200915楼
2019-12-06 18:01   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
·
miaojiabing16楼
2019-12-09 11:39   回复  
tzynew17楼
2019-12-09 19:25   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
shehuifei19楼
2020-11-14 21:19   回复  
likecitywo20楼
2020-11-14 21:20   回复  
gofast11221楼
2020-11-14 21:21   回复  
Haibo_22楼
2020-11-14 21:22   回复  
icanspll23楼
2020-11-14 21:23   回复  
yaqianye24楼
2020-11-14 21:23   回复  
zzhello25楼
2020-11-14 21:24   回复  
howtoge26楼
2020-11-14 21:27   回复  
蓉蓉番薯27楼
2020-11-15 00:09   回复  
LifePursuit28楼
2020-11-15 19:26   回复  
bjdxyxy30楼
2021-04-19 21:06   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
相关版块跳转 我要订阅楼主 寒冬夜寂 的主题更新
351/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件) SCI英文润色翻译-EnPapers美团队-先修改后付款
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[留学DIY] 10043以后咋出去啊 +3 RuiLove 2024-04-22 3/150 2024-04-27 12:16 by icm639
[基金申请] 两类问题算是白选了~ +8 jurkat.1640 2024-04-23 13/650 2024-04-27 12:03 by 淀粉搬运工
[教师之家] 博士论文被抄袭 +26 和尚敲小木鱼 2024-04-22 43/2150 2024-04-27 11:14 by liuyuzhou
[基金申请] "颜宁:基础研究应顶天立地"能做到基础研究同时顶天立地的才是牛人 +6 zju2000 2024-04-24 6/300 2024-04-27 10:17 by kcmn1000
[论文投稿] with editor 两个月了，什么原因？ +7 yiersan9 2024-04-24 16/800 2024-04-27 03:25 by yiersan9
[考博] 真的好想读博！ +15 wangzhe_bs 2024-04-22 22/1100 2024-04-26 22:11 by 小木雄子
[论文投稿] 研二光催化6月底四篇二区什么水平 5+5 wjtab 2024-04-22 15/750 2024-04-26 19:25 by wjtab
[有机交流] 环肽的合成 +3 徐来不惊 2024-04-25 5/250 2024-04-26 16:56 by 徐来不惊
[考研] 学硕专硕 +5 小蜗牛* 2024-04-26 5/250 2024-04-26 16:43 by 鱼翔浅底1
[考研] 381求调剂 +4 小刺猬987654321 2024-04-25 6/300 2024-04-26 10:57 by czl12138
[考博] 取博导收留 5+4 zzb777888 2024-04-20 10/500 2024-04-26 08:52 by polymerfriend
[考博] 求博导 +6 好okjh 2024-04-21 10/500 2024-04-25 14:04 by 好okjh
[电化学] 耗材发问 +4 Happy C 2024-04-22 4/200 2024-04-25 11:03 by 普通小虫
[访问学者] CSC的访问学者申请，没有个评审意见，也不知道怎么改，还有必要申请吗 +4 flyingship 2024-04-20 4/200 2024-04-24 21:09 by 59038mute
[考博] 24年 申博 化学/材料 一作6篇sci +9 wangyp123 2024-04-23 11/550 2024-04-24 19:01 by bangbangbiu
[基金申请] 化学结清有情发出来了 +3 starboy7286 2024-04-20 3/150 2024-04-24 15:52 by 嘿，黑贝
[考博] 博士招生 +4 zx179 2024-04-24 7/350 2024-04-24 15:01 by H考研成功
[教师之家] 找工作过程中碰到好多人问南京某新换校长211的政策，规定如下 +15 ZHONGWU_U 2024-04-21 17/850 2024-04-24 05:12 by juta256
[高分子] 请问UV灯是365nm的，那么选光引发剂的波长选多少的？要完全一致吗？ +4 engledd2004 2024-04-21 4/200 2024-04-22 16:08 by wangcz23
[论文投稿] 研究光催化的，好中的三四区 20+3 sl.0117 2024-04-20 3/150 2024-04-22 09:53 by bobvan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭