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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR反应需要做标曲吗
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR反应需要做标曲吗已有2人参与

各位大虾，我想通过相对定量的方法比较一个基因在两个不同样本中的表达量差异，已经选择16s rRNA为内参基因，查阅了很多资料，现在有几个问题：
1.如果选择2−ΔΔCt法，是不是需要做标准曲线呢？
2.如果选择ΔCt法，需要做标曲吗？（我有个同学说他用的这个方法，当时没有做标曲，我有点困惑）
3.这两种方法可以任意选择吗，有没有什么限制
谢谢各位，祝大家实验顺利
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1楼2019-08-31 21:24:14
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
2楼2019-08-31 22:16:13
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by prthefu at 2019-09-01 12:48:03
你是要做相对定量来比较表达差异情况，双△法，不需要做标曲。整理Ct值，做柱状图就可以比较出来。
标准曲线是绝对定量需要的。

可是不做标曲怎么判断引物是否设计地合理呢？
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4楼2019-09-01 20:12:25
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by prthefu at 2019-09-01 12:48:03
你是要做相对定量来比较表达差异情况，双△法，不需要做标曲。整理Ct值，做柱状图就可以比较出来。
标准曲线是绝对定量需要的。

而且我看到了这样一段话。。应该是要做标曲的吧
荧光定量PCR反应需要做标曲吗
360截图1624122486130110.png
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5楼2019-09-01 20:15:37
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by youngen at 2019-09-01 20:24:11
如果没有靠谱的参考值，就需要标准曲线作参考

嗯嗯，我知道了，谢谢
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7楼2019-09-01 22:24:15
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by prthefu at 2019-09-02 08:55:45
关于扩增效率，好像是都应该知道的吧，引物扩张效率要基本一致...

怎么知道的呢
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10楼2019-09-02 09:05:32
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by prthefu at 2019-09-02 08:56:34
你所谓的判断引物是否设计合理，就是看引物扩增特异性和扩张效率吧...

扩增特异性可以从熔解曲线看，扩增效率要从什么看呢
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11楼2019-09-02 09:07:08
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 拉斐尔之力 at 2019-09-06 00:44:52
没有其他的内参选择了吗。我自己qpcr用18s当内参的时候感觉不太对

这个内参是我看文献找到的，别人做QPCR也用的这个基因。不过我现在出现了一个问题，我发现目的基因表达量下调了，这是不符合预期的，请问排除操作不准确的原因还有哪些可能的因素会造成基因表达量不准确呢
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15楼2019-09-06 09:51:42
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