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CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤--donor载体构建载体构建
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1、质粒骨架的选择 crispr/cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，mammalian 、bacteria 、drosophila 、plant、c. elegans 、yeast 、zebrafish 、xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、c2c2（可剪切rna）。当然，还有一些筛选标记，如puro、gfp、rfp、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种，最具有争议的ngago，本楼主，和大多数重复的人一样也重复过这个试验，gfp验证试验时，看到荧光显著减弱（还特意构建了一种ngago载体），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾当时想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证； 2、酶切位点的选择 插入sgrna的酶切位点，质粒基本为这两种，bsmbi和bbsi，具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有，使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！！ 1、质粒骨架的选择 crispr/cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，mammalian 、bacteria 、drosophila 、plant、c. elegans 、yeast 、zebrafish 、xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、c2c2（可剪切rna）。当然，还有一些筛选标记，如puro、gfp、rfp、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种，最具有争议的ngago，本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样，gfp验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种ngago载体，效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证；最终结果是刘东老师使用ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷），这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据，最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好，knock down 有表型，如果没表型，估计也会放弃。这里就说到这，有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有，网址http://www.addgene.org/crispr/。 2、酶切位点的选择 插入sgrna的酶切位点，质粒基本为这两种，bsmbi和bbsi，具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有，我就不啰嗦了。哦还忘了一件事，使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！！  1  2.png  3.png  4.png 3、同源臂的设计 同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段，长度大约1kb-2kb，效率还可以。当然了，有人也用40-100bp做了也做成功了，但基本原则是越长效率越高。1kb-2kb效率已经很高，所以这个最合适。有相关文献支持，自己pubmed查看。 4、启动子、目的基因及其终止子的扩增 这里也没什么可说的，启动子在我们选择质粒的时候就决定了，当然我们还可以改造以提高sgrna的表达效率，这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子，替换上去就ok了。 目的基因的话，如果我们要做敲除，基本就是根据基因组，在外显子区域设计sgrna序列，切割后以非同源性末端接合（non-homologous end joining, nhej），造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式，同源性重组（homologous recombination，hr）同源性重组修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性，若其中一条染色体上的dna发生双股断裂，则另一条染色体上对应的dna序列即可当作修复的模版来回复断裂前的序列，因此在某些条件下，同源性重组又称作基因转换（gene conversion）。该方法是用于敲入基因，这个同时，我们可以加入抑制nhej修复的酶，同时就会促进hr修复，提高重组插入效率。 终止子的话，没什么特别，基本可以通用，sv40终止子、bgh终止子等。 5、donor载体的连接及克隆测序 donor载体的连接及克隆测序这个就是我们分子生物学学生的基本功了，就不叙述了。 6、细胞转染及载体功能的验证 细胞转染的话，参见说明书就好了，转染试剂有lipo2000（适合sirna和dna共转染）、lipo3000（适合dna）、以及罗氏、qiagen的等。当然还有国产的一些转染试剂，实验室穷点就可以买下，效果还可以，汉恒生物的，比较便宜。 另外还给大家推荐一个课程，都是一些比较基础性地，有需要的话，大家可以看看附件的推荐。 |
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2019-05-14 10:49:55, 67.16 K
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