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lujiaoqia

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[资源] CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤--donor载体构建载体构建

1、质粒骨架的选择
crispr/cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种,mammalian 、bacteria 、drosophila 、plant、c. elegans 、yeast 、zebrafish 、xenopus,根据质粒所携带的编辑基因的不同,可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、c2c2(可剪切rna)。当然,还有一些筛选标记,如puro、gfp、rfp、mcherry、潮霉素等等,我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种,最具有争议的ngago,本楼主,和大多数重复的人一样也重复过这个试验,gfp验证试验时,看到荧光显著减弱(还特意构建了一种ngago载体),但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低,非常遗憾当时想法太简单,以先入为主认为是切割而没有去验证;

2、酶切位点的选择

插入sgrna的酶切位点,质粒基本为这两种,bsmbi和bbsi,具体可以参见该质粒的protocol,后续的连接、转化、验证protocol里面有,使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱,非常方便,强烈推荐!!
1、质粒骨架的选择

crispr/cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种,mammalian 、bacteria 、drosophila 、plant、c. elegans 、yeast 、zebrafish 、xenopus,根据质粒所携带的编辑基因的不同,可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、c2c2(可剪切rna)。当然,还有一些筛选标记,如puro、gfp、rfp、mcherry、潮霉素等等,我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种,最具有争议的ngago,本楼主也重复过这个试验,也和大多数重复的人一样,gfp验证试验时,看到荧光显著减弱(本人还特意构建了一种ngago载体,效果比韩老师的效果好很多),但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低,非常遗憾自己想法太简单,以先入为主认为是切割而没有去验证;最终结果是刘东老师使用ngago发现了有表型(斑马鱼的眼睛上有缺陷),这个就是很强的提示,需要去做下一步,尽管基因组上没有被切割,有表型,那势必会去看该基因表达的数据,最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好,knock down 有表型,如果没表型,估计也会放弃。这里就说到这,有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有,网址http://www.addgene.org/crispr/


2、酶切位点的选择

插入sgrna的酶切位点,质粒基本为这两种,bsmbi和bbsi,具体可以参见该质粒的protocol,后续的连接、转化、验证protocol里面有,我就不啰嗦了。哦还忘了一件事,使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱,非常方便,强烈推荐!!

CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤--donor载体构建载体构建
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CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤--donor载体构建载体构建-1
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CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤--donor载体构建载体构建-2
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CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤--donor载体构建载体构建-3
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3、同源臂的设计

同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段,长度大约1kb-2kb,效率还可以。当然了,有人也用40-100bp做了也做成功了,但基本原则是越长效率越高。1kb-2kb效率已经很高,所以这个最合适。有相关文献支持,自己pubmed查看。


4、启动子、目的基因及其终止子的扩增

这里也没什么可说的,启动子在我们选择质粒的时候就决定了,当然我们还可以改造以提高sgrna的表达效率,这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子,替换上去就ok了。

目的基因的话,如果我们要做敲除,基本就是根据基因组,在外显子区域设计sgrna序列,切割后以非同源性末端接合(non-homologous end joining, nhej),造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式,同源性重组(homologous recombination,hr)同源性重组修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性,若其中一条染色体上的dna发生双股断裂,则另一条染色体上对应的dna序列即可当作修复的模版来回复断裂前的序列,因此在某些条件下,同源性重组又称作基因转换(gene conversion)。该方法是用于敲入基因,这个同时,我们可以加入抑制nhej修复的酶,同时就会促进hr修复,提高重组插入效率。

终止子的话,没什么特别,基本可以通用,sv40终止子、bgh终止子等。

5、donor载体的连接及克隆测序

donor载体的连接及克隆测序这个就是我们分子生物学学生的基本功了,就不叙述了。

6、细胞转染及载体功能的验证

细胞转染的话,参见说明书就好了,转染试剂有lipo2000(适合sirna和dna共转染)、lipo3000(适合dna)、以及罗氏、qiagen的等。当然还有国产的一些转染试剂,实验室穷点就可以买下,效果还可以,汉恒生物的,比较便宜。

另外还给大家推荐一个课程,都是一些比较基础性地,有需要的话,大家可以看看附件的推荐。
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chaonai17

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2楼2019-05-14 15:50:31
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prthefu

木虫 (著名写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by chaonai17 at 2019-05-14 15:50:31
好巧啊!!我也在看那个课程,我的是昨天免费选的2个一个是如何利用生物信息学技术进行科研选题,另一个是30分钟精通基因序列分析方法

请问,你们这说的是哪个课程啊,最近我也在学习编辑这部分,望多指导啊
3楼2019-05-16 09:03:09
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lujiaoqia

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4楼2019-05-16 09:07:57
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小木虫爱科学

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感谢
7楼2019-07-12 11:07:06
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2019-05-17 17:11   回复  
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杜瓜瓜10楼
2019-12-05 20:54   回复  
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