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wx1308897716木虫 (小有名气)
神虫
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片段太长扩不出来怎么办已有4人参与
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| 我需要克隆拟南芥里面一个基因的CDS，但是有四千多bp，扩不出来怎么办 |
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【答案】应助回帖
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wx1308897716: 金币+17, ★★★★★最佳答案 2018-05-17 10:53:49
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wx1308897716: 金币+17, ★★★★★最佳答案 2018-05-17 10:53:49
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惭愧，很少回答问题。 4 K 左右的片段一般来说并不长，如果扩不出来，可以从以下几个方面或策略考虑： （1）普通PCR策略：因为给的信息很少，可以从以下几个方面依次考虑改善，第一，引物设计是否合适，可以适当增加引物长度，比如到25 bp以上，甚至30 bp以上，以增强引物与模板间的结合强度，这样的引物要在扩增程序上适度更改，比如延长变性时间使变性更充分，或者延长退火时间，也需要检查引物设计的其他基础因素，不过如果是用于扩增 CDS，可能只能考虑 ATG 开头，TGA结尾，那选择余地不多，就尽量满足条件吧；第二，模板的相关因素，扩增CDS用的一般是总 cDNA，一般要考虑这么几方面，cDNA 的质量如何？如果目的基因丰度低，cDNA质量又差，那肯定会影响扩增量，cDNA 在体系中加入的量如何？一般参考酶的说明书，一般体积不超过总体积的1/10吧，对于加入的纳克数也有要求，不能太低也不能太高，而且如果cDNA模板中含有大量杂 RNA，尿嘧啶U会对高保真酶扩增产生不利影响，第三，PCR酶的品牌，各个公司的体系、酶的质量、扩增能力都有一定差别，我们一般用的是 Phusion，或者是东洋纺的NEO，东洋纺的便宜很多也比较好用，对于它的体系来说，如果扩增不好，可以添加一定量的DMSO以降低退火条件，同时增加 Mg离子浓度，提高酶的活性，这两条对于其他酶来说也适用，此外，对于 cDNA模板来说，延伸时间可以适度延长，以适应不同cDNA模板可能存在的复杂结构，第四，不知道你是一丁点都扩增不出来吗？还是可以扩出来但是非常非常微弱，如果是后者，可以试着使用胶回收产物进行PCR，以提高特异模板的浓度。 （2）如果以上几个方面的常规问题都避免了，仍然效果很差，可以像前面几位虫友的建议，分段 PCR 后再进行拼接，大体是这样的流程和设计方式：片段是 4 K，一般可以考虑分成两段，比如每段 2 K（按你的片段实际情况去分割，当然理论上你尽可以随意的分段），分别扩增，分别是 fragment-1（f1） 和 fragment-2（f2），给每一段都设计好特异的引物，然后在f1的下游引物和f2的上游引物添加相应的同源互补序列，也就是f1的下游向f2那条片段一侧延伸15到20个bp，f2的上游向f1一侧延伸15到20个bp，这样扩增出来的f1与f2经过胶回收后，按照一定比例（一般1:1）混合均匀作为第二轮的模板进行PCR，f1下游和f2上游添加的那一段序列在退火时可以互补，从而形成一段全长的序列用于扩增其完整全长，引物的话就可以直接用你第一轮PCR时f1的上游和f2的下游。 当然，也可以不用PCR去扩增全长，可以直接使用Gibson Assembly的方法直接构建入载体中，不过这时需要在f1上游和f2下游引物添加来自于载体的同源重组序列，具体参考相应产品说明书，很简单。 大体可以从以上方面改善，多试试，4 k应该不算难得，此外如果是因为模板序列的碱基组成很特殊，可以选用一些特殊配方的PCR试剂来改善效果。 祝好！ |
11楼2018-05-16 17:11:38
wx1308897716
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7楼2018-05-16 11:47:41
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5楼2018-05-15 21:28:23
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6楼2018-05-15 22:08:15
wx1308897716
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8楼2018-05-16 11:49:42
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