实验用利福平溶液的配制
1. 50 mg/mL stock solution in methanol.
2. Vortex immediately to prevent rifampicin from sticking to bottom of tube.
3. Add ~5 drops 10 N NaOH per mL to facilitate dissolving.
4. Add 2 mL per liter of culture to achieve a working concentration of 100 μg/mL.
也可以采用下面的配制方法：
Alternately, dissolve 50mg/mL in DMSO and vortex to suspend. In this form, you don't need NaOH. Store at -20°C.
我是用DMSO配制的，50mg/mL -20°C储存，加到培养基里的终浓度是50ug/ml
1、将-20保存的菌液加入10mLYEB(Kan20+str20+Rif40)中，假如比例为1：100，然后在
28度250rpm的摇床培养大概两天，再将哦诶样所得的菌液按1：100的比例加入250mL
新鲜的YEB中继续按上述条件培养，大概16h后取出并在4度5000rpm离心5min收集菌体，
倒掉上清，用250mL转化液悬浮菌体。
2、转化液的配制：MS粉2.21g/L+蔗糖5g/L+Silwet L-77 0.1% (用氢氧化钠调PH至5.8)
3、转化前一天将植株浇透。
4、第一次将花序浸入转化液中20s，然后直接放入温度适宜的培养箱暗培养18-24h，5-7天后第二次浸染我直接有枪将转化液滴在花蕾上然后暗培养，要说明的是我两次浸染后都没有保鲜膜包住植株保湿。
anne9000 发表于 2008-4-24 15:45
楼上说的很详细了，我再补充几个要点：
1、一定要加silwet-77
2、如果你最后配成的渗透液浓度大，侵染过夜后要用清水冲洗花序，如果浓度不大，就不用了。
3、我侵染了1分钟左右。
4、侵染后花盆要平放。
5、你用的载体是什么抗性？你的筛选培养基需要先做个实验，确定植株和载体对抗生素的耐受浓度。我做的实验，资料显示KANA浓度需要50mg/ml。最后事实证明是40。
6、一般潮霉素抗性，是大苗和小苗的差别，如果用卡那抗性，没有转进去的会变成白化苗，一般见光7天后就可辨认出来。一分辨出来就移栽，不要让呆很长时间。
朝天椒 发表于 2008-4-25 12:06
看了楼主的步骤，我们用的转化液就是MS加蔗糖,加silwet-77没有调pH。侵染时间1-3min，侵染后花盆平放覆保鲜膜并黑暗培养24h后正常条件培养至结果，无需第二次浸染，浸染一定要彻底，保证每朵花蕾都被浸染。我认为最关键的不是用什么浸染怎样浸染，而待转化拟南芥的生长状态，一棵强壮的植株可以获得几十棵阳性，而几十棵弱小植株也无法获得一棵阳性苗。
yunjingli 发表于 2008-4-28 11:09
首先谢谢
我也即将要转化拟南芥了
看了之后帮助很大，目前我们实验室在这块不是很健全，我想请教一下在拟南芥转化后得到To代株系后，用卡拉霉素怎样进行筛选，然后怎样把阳性的植株栽倒土里，成活率会提高。
hnanng 发表于 2008-4-29 14:34
我做的过程中发现暗培养的条件不能太长。长了就可能结实不多影响转化效率
bioflower 发表于 2008-4-29 19:59
学习学习，原来也做过，过程差不多
臭妞妞 发表于 2008-4-30 15:04
各位，有没消毒拟南芥转化子的标准程序啊？偶将不胜感激啊！
以前用过抽真空法，效果并不好，后来直接沾花
我的转化液只有蔗糖和silwet-77
我一般先挑菌小摇，之后再扩繁，其实YEP还是LB差别不是很大
摇好的菌液OD在1.5--3之间，加转化液后0.75-1.5.
最重要的就是苗的状态，有时候长的好的苗三四棵就足够的
1. 50 mg/mL stock solution in methanol.
2. Vortex immediately to prevent rifampicin from sticking to bottom of tube.
3. Add ~5 drops 10 N NaOH per mL to facilitate dissolving.
4. Add 2 mL per liter of culture to achieve a working concentration of 100 μg/mL.
也可以采用下面的配制方法：
Alternately, dissolve 50mg/mL in DMSO and vortex to suspend. In this form, you don't need NaOH. Store at -20°C.
我是用DMSO配制的，50mg/mL -20°C储存，加到培养基里的终浓度是50ug/ml
总RNA提取的原理、步骤、逆转录cDNA及注意事项
2008-06-30 14:56:00| 分类： RNA |字号 订阅
1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法）
TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
2.主要步骤
细胞或组织，加入0.4ml RNAiso Reagent 后匀浆
室温静置5分钟
加入1/5 RNAiso Reagent 体积量的氯仿，剧烈震荡混匀
室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟
将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀
室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清
向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟
弃上清保留沉淀，干燥
溶解于11μl的DEPC处理水中
注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。
3.RNA逆转录成cDNA
具体操作按照MBI Fermentas的RevertAidTM First Strand cDNA Synthsis Kit ＃K1622。如果cDNA当天不使用，则要保存在-20℃或-70℃。
RNA逆转录成cDNA操作流程简图如下：（在冰盒上操作）
1.提取的RNA溶解于11 μl DEPC-treated water， 加入1 μl oligo(dT)18 primer(0.5 ug/ul)轻微震荡后离心3-5sec
在PCR扩增仪上70℃ 5分钟。
2.冰上冷却，并短暂离心，向反应体系中加入5×reaction buffer 4μl，RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μl) 1μl，10 mM dNTP mix 2μl。
3.轻微震荡后离心3-5sec，在PCR扩增仪上37℃ 5分钟。
4.向反应体系中加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1μl，在PCR扩增仪上42℃ 60分钟，70℃ 10分钟。
5.收集反应产物，冰上冷却
4.注意事项
①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在15 -30°C的条件下。
⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制：将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。)
⑥每50—100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。
⑦单层生长的细胞 直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的TRIZOL溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIZOL量（每10 cm2加1 ml）。当TRIZOL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。
⑧在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（RNA洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。
5.试剂盒：
①组织裂解液：TaKaRa RNAiso Reagent（大连宝生物Takara公司）
②逆转录试剂盒：Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI公司）
6.所需实验耗材：
①无菌且灭活RNA酶的枪头（200μl和20μl）
②0.01% (v/v) DEPC处理水
③冰盒
④EP管
⑤0.2ml的PCR反应管
⑥氯仿
⑦异丙醇
⑧75%乙醇（用DEPC水配制）
实时荧光定量PCR（Real time-PCR）
一.原理：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
二.几个重要概率：
①扩增曲线
图略
扩增曲线 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集
②荧光阈值
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值
荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99
真正的信号:荧光信号超过域值
③ Ct值
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
C(t) value
图略
Ct值的特点：
1）相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
2）Ct值则极具重现性
三．实时荧光定量PCR 方法
① SYBR Green法
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
变性时，DNA双链分开，无荧光
复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
反应体系的建立及优化:
SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测
Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
反应Buffer 体系的优化
反应温度和时间参数:由酶和引物决定
其他与常规PCR相同
② TaqMan探针法
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光
Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光
TaqMan探针法PCR反应的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S
60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高）
也可通过温度梯度优化退火温度
72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
引物浓度：50-900nM
探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同
四．实时荧光定量PCR法定量方法
绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线
相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）公式： 2-△Ct 一般相对定量内参基因为GAPDH
五．试剂盒：
探针法： TaqMan® Universal PCR Master Mix（ABI公司）
荧光染料法：SYBR Green Master Mix（ABI公司）
六．所需实验耗材：
①无菌且灭活RNA酶的枪头（200μl和20μl）
②PCR反应8排管
③EP管
反转录
反转录简单点说就是从RNA生成CDNA的过程。所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。
AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。
三、cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成方法有以下几种:
(1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。
(2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。