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观享世界

木虫 (小有名气)

[求助] 您好,我最近用感受态大肠杆菌扩增质粒时,最终抽得的质粒浓度都... 已有2人参与

您好,我最近用感受态大肠杆菌扩增质粒时,最终抽得的质粒浓度都非常低,只有十几ng/ul,我怀疑是涂板时长了杂菌,因为长的菌落的颜色偏白,不像大肠杆菌,但是我不清楚原因到底出在了哪。我感觉LB板中抗生素失效的可能性还是比较大的,我所用的板是带有卡那的,为了弄清问题所在,我重新配了混有卡那霉素的LB板,用没有转质粒的感受态大肠杆菌涂板,结果长了很多菌落,这是什么原因呢?难道是我们实验室的卡那霉素失效了?但是我听说卡那霉素存放期很久,一般不会失效的。即使是卡那霉素失效了,为什么只长了颜色发白的菌落,而不是平时筛选成功时长的那种略微有点透明的大肠杆菌菌落呢?对了,要说明一下,在操作过程中出现污染的可能性不大,因为同样的操作,涂混有氨苄的LB板就没有问题。 @biostar2009

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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

2楼3楼的分析很对,

如果菌落只出现在卡那板,氨苄板没有,那极有可能是你用的感受态污染。

如果是自制的感受态,做好之后可以把残留的那么点,一样涂一点氨苄和卡那的板,直接涂。如果不长,至少可以排除这两个抗性菌的污染。

如果热击之后长了,那有可能是耗材或者试剂的质粒污染。

如果不考虑上面说的没转质粒的感受态也能长菌落,抽不出质粒的原因也很多。抽提试剂没有问题的情况下,低拷贝质粒,有些很奇怪的高拷贝质粒,都会出现。

思考认真,赞一个,继续努力

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7楼2016-02-24 09:46:29
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
个人认为抗生素失效以后,菌长的是满板,根本看不到单克隆。你的菌落PCR鉴定的怎么样,提质粒后酶切鉴定过没有?有没有可能感受态混了含有卡纳抗性的菌。
2楼2016-02-24 09:00:47
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renzhiq

木虫 (小有名气)

你看你的问题就知道你是菜鸟,感受态的问题,你用的感受态是买的还是自己实验室做的,是做的就全丢了,是买的就找公司……祝实验成功,金币全给我哈,少一个便不再继续回复你的问题……

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3楼2016-02-24 09:19:28
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by renzhiq at 2016-02-24 09:19:28
你看你的问题就知道你是菜鸟,感受态的问题,你用的感受态是买的还是自己实验室做的,是做的就全丢了,是买的就找公司……祝实验成功,金币全给我哈,少一个便不再继续回复你的问题……
...

我看你还是挺有自知之明的,不要回答问题,最好再也不要!
5楼2016-02-24 09:32:21
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
刚才忘了应助,重新回来转一圈……

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4楼2016-02-24 09:29:42
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观享世界

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-02-24 09:00:47
个人认为抗生素失效以后,菌长的是满板,根本看不到单克隆。你的菌落PCR鉴定的怎么样,提质粒后酶切鉴定过没有?有没有可能感受态混了含有卡纳抗性的菌。

还没有鉴定,混有含卡那抗性的菌可能性应该不大,因为两个月前用同一批菌做过实验,没有什么问题,而且菌种都是分装很多管的,应该不会有污染

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书写人生
6楼2016-02-24 09:45:12
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观享世界

木虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2016-02-24 09:46:29
2楼3楼的分析很对,

如果菌落只出现在卡那板,氨苄板没有,那极有可能是你用的感受态污染。

如果是自制的感受态,做好之后可以把残留的那么点,一样涂一点氨苄和卡那的板,直接涂。如果不长,至少可以排除这两 ...

谢谢

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书写人生
8楼2016-02-24 12:15:45
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renzhiq

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2016-02-24 09:32:21
我看你还是挺有自知之明的,不要回答问题,最好再也不要!...

菜鸟!你倒是先验证谁给你的回复是对的啊……

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9楼2016-02-24 23:08:39
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观享世界

木虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by renzhiq at 2016-02-24 23:08:39
菜鸟!你倒是先验证谁给你的回复是对的啊……
...

昨天用这个感受态扩增另一个质粒,是氨苄抗性的,很成功,质粒浓度也很高,酶切验证也正确

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书写人生
10楼2016-02-25 09:49:53
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