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jimny22金虫 (正式写手)
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[交流]
[求助]请问质粒快检时为什么只有基因组和RNA条带，不见质粒条带（附图，有对照）
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请问质粒快检时为什么只有基因组和RNA条带，不见质粒条带（附图，有对照） 附件1是我的protocol 附件2是电泳图 请赐教。谢谢。 |
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2楼2008-10-07 10:11:27
jimny22
金虫 (正式写手)
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质粒DNA快速检测 (一) 实验原理 大肠杆菌在碱性条件下，经表面活剂SDS破壁，细胞破碎后，细胞内含物释放出来，然后用高浓度的盐和SDS一起将蛋白质和细胞壁等大分子沉淀，通过离心将这些杂质沉淀在离心管底部，而质粒悬浮在蔗糖溶液中，将上清点样、电泳就能检验出是否有质粒的存在。 (二) 实验器材 (1) 活材料：大肠杆菌TG1感受态细胞 (2) 药品 Amp 100mg/m1 EDTA (pH8.0) 10mmol/l KCl 4mol/l NSS溶液 NaOH 0.2mol/l （2mol/l 100μl） SDS 0.5% （1% 500 μl） 蔗糖溶液 20% （50% 400μl） 稀释至 1000 μl 裂解菌体溶液分别配制、用时混合。NaOH先配制成2 M，SDS先配制成1%，蔗糖先配成50%的母液，用时分别顺序取3种母液100μl，500μl，400μl稀释至1000μl，现配现用。 器材：微量移液器，微量离心管（PCR管），灭菌牙签。 (三) 实验方法 (1) 在含适当抗生素的LB平板上培养转化了适当质粒的菌落，知道它们的直径长至2~3mm（对于大多数菌株，需在37℃培养18-24h） (2) 用无菌牙签将细菌菌落的一小块转移到含适当抗生素的已在背面画格标号的LB母板上，将该菌落的剩余部分转移到已标号的PCR管中，(管内含有50μl无菌的10mmol/l EDTA (pH8.0))。 (3) 重复步骤(2)，直到收获预期目的菌落。 (4) 当所有菌落被复制和转移之后，将母板在37℃培养几个小时后于4℃保存，直到得到凝胶电泳结果（步骤11）。然后从母板上收获其质粒为预期大小的菌落。 (5) 在培养母板的时候，对细菌菌悬液进行以下处理：在每一PCR管加入20μl新配制的NSS溶液（NaOH 100μl，SDS 50μl，0蔗糖溶液 400μl），盖上管盖，振荡30s。 (6) 将所有PCR管放入70℃温浴5min，冷却到室温。 (7) 接着加1.5μl 4mol/l KCl，振荡混匀30s。 (8) 冰浴5min。 (9) 在4℃以最大速度离心3min以除去细菌碎片。 (10) 将50μl上清液点样电泳。 (11) 待指示染料移到凝胶总长的2/3到3/4，取出凝胶在EB中染色15min，在水中冲洗15min左右。在紫外检测仪上观察结果。并拍照。 (12) 将母板上可能含有重组子的菌落接种到含适当抗生素的2ml液体LB培养基中，进行小规模培养。（不需要等到母板上的菌落长的很大，细菌即使只是薄薄的一层，也足够接种使用）。 (13) 用此小规模培养物小量制备待测的重组子质粒，用酶切及琼脂糖电泳分析质粒DNA，以确证其大小和结构与预期一致。 (四) 注意事项 (三的步骤2中) 除待试菌落外，还应转移几个“空”菌落（不含外源基因的质粒载体）。这几个样品可在凝胶电泳中用作分子质量参照物。 这是因为用其他方法制备的质粒作为对照不可靠，原因是溶解它们的缓冲液含有不同的离子浓度和其他成分。而超螺旋DNA的迁移率会受到加至凝胶孔中的溶液中的离子强度的显著影响。 |
3楼2008-10-07 11:38:27
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司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 7-23 19:09
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 7-23 19:09
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4楼2008-10-08 09:44:43
