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Western blot的原理、操作及注意事项
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| Western blot的原理、操作及注意事项 |
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2楼2008-11-08 05:05:16
Western blotting
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免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。 免疫印迹法(immunobiotting test,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似,亦被称为Western-blot. 免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白 样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越 快.此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带).第二阶段为电转移:将在凝胶 中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1～2A),通电45min 转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位:将印有蛋白质条 带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加 入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色.常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈 棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子 量标准,确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性, 是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断.在艾 滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶 标抗体及显色底物制成的试剂盒,可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断 有无针对病毒的特异性抗体. 免疫印迹法 免疫印迹法 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、试剂准备 1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。 2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。 3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。 4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。 5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。 6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。 三、操作步骤 （一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。 （二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。 （三）转移：（半干式转移） 1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。 2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。 3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。 （四）免疫反应： 1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。 2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。 3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。 4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。 5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。 6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。 7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。 8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 四、注意事项 1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。 3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。 |
3楼2009-07-29 21:00:12
电泳缓冲液试剂的配制
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50×TAE Buffer (pH8.5) 组份浓度:2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA 配制量:1 L 配制方法: 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 Tris 242g Na2EDTA.2H2O 37.2g 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加入57.1 ml的醋酸，充分搅拌。 4. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。 10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度:890 mM Tris-硼酸, 20 mM EDTA 配制量:1 L 配制方法: 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 Tris 108g Na2EDTA.2H2O 7.44g 硼酸 55g 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。 组份浓度: 10 mg/ml 溴乙锭 配制量:100 ml 配制方法: 1. 称量1 g 溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2. 加入去离子水100 ml，充分搅拌数小时完全溶解溴乙锭。 3. 将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4. 溴乙锭的工作浓度为0.5 mg/ml。 注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。 |
4楼2009-07-29 21:01:02
PCR---引物primer
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1、引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 2.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。 3.设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 4.避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 5.避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 6.避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。 8. 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当 50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。两引物的 Tm 值相差不应大于 5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 15-2个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算 14-7个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的 Tm, 也可用于扩增产物的 Tm 计算Tm=81.5+16.6*lg[K ]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物 Tm 可能差异不小：GGGAA和 GAGAG 的 Tm 是不一样的，所以确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如 Primer5 等均使用近邻分析法。 目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。 2、引物退火温度 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。 设定Tm有几种公式。表4列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 3. use引物 引物以干粉形式运输。最好用TE重溶引物，使其最终浓度为 100|ì。TE比去离子水好，因为水的 pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心 TE对于 PCR 的影响，不妨用 ddH2O. 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于 10uM 浓度溶于 TE的引物在-20℃可以稳定保存 6 个月，但在室温（15℃到 30℃）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20℃保存至少 1 年，在室温（15℃到 30℃）最多可以保存2 个月。 注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1到 0.5uM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 |
5楼2009-07-29 21:01:56
Western Blotting
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 即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 western blotting 实验试剂 1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺 将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。 小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 2）4×Tris•Cl/SDS, pH8.8, 在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8, 补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。 3）4×Tris•Cl/SDS, pH6.8, 在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8, 补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。 4）4×SDS电泳缓冲液 Tris base 24.2 g Glycerin 115.3 g 20%SDS 20 ml 加水至总体积1000ml。 应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。 5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。 6）10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。 步骤 1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。 2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。 表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制 试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml) 5% 8% 10% 12% 15% Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50 4×Tris•Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75 10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5％的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。 3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。 4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。 聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。 5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。 6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。 表7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制 GEL%（3.9%) Total (10.05ml) Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml 4×Tris•Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml H2O 6.10 ml 10%过硫酸铵 0.05 ml TEMED 0.01 ml 7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。 8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。 对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。 2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制： 成 分 体积 (ml) 0.5M Tris•Cl (pH6.8) 12.5 20%SDS 11.5 Glycerin 10 2% Blue-Bromo-phenol 2.5 β-mercaptoethanol * 5.0 加H2O至总体积50 ml，分装 *β-mercaptoethanol 在临用前加入。 9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。 10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。 11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。 12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。 13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。 14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。 15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。 16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。 17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。 18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。 19)转膜 将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。 1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). 2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). 3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS). 4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS). Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations 20)、清洗 将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！） 21)、封闭 1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20). 2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃. 22)、一抗孵育 一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。 Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml. 23)、清洗 将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。 24)、二抗孵育 二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。 25)、清洗 同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。 26)、显色 按如下配方配制显色液： 1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C 将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。 |
6楼2009-07-29 21:08:18
7楼2009-08-21 07:10:44
8楼2009-08-25 09:21:57
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松上云雀
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