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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质纯化问题 已有9人参与

各位大神,我做了蛋白质的原核表达实验,能清晰的看到目的蛋白质表达了(载体是PET-28a,宿主是BL21(DE3)),但是我后面做蛋白质纯化实验的时候不能纯化到蛋白。我的超声波破碎细胞的条件是:400W,5S破碎,5S停止,30分钟,后面分别SDS-PAGE检测上清液和沉淀,发现上清液没有纯化到我的蛋白,蛋白都在沉淀里面了,条带特别明显,不知道怎么回事?是不是细胞没有破碎完全呢?怎么样才能解决这个问题?求大神指点,相互交流。谢谢!
蛋白质纯化问题
IMG_20160108_170606.jpg
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好好生活,好好工作
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掌控恶魔

新虫 (小有名气)


一般和破碎的条件没有关系,理论上可能影响而已,主要还是和你基因设计的问题,你可以重新设计。也可以尝试重新摸索表达的条件,时间、诱导剂加入点,温度等等方面进行着手就可以免去之前的基因设计了。
不过你的目的蛋白已经表达了,看你对于蛋白的要求,并不是说包涵体的蛋白不能用,我们每年都纯化百来个的包涵体蛋白。也没啥影响,你现在可以最好了解一下你用包涵体做的话有没有问题
22楼2016-02-03 10:30:10
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这有什么奇怪,超声破碎后菌夜什么情况,是比较清的那种还是发白?如果发白可能是包涵体或者蛋白变性了
2楼2016-01-18 10:04:38
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XMC-7

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
莫慌莫慌,看你表述的情况,并不奇怪啊。破菌后,目的蛋白不溶于破菌Buffer,下面离心后增溶纯化就是了。额,是没人带的可怜新手么?
能帮的帮,难事求助的心情咱也经历过
3楼2016-01-18 10:17:14
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
超声破碎,上清里面没有目的蛋白,全沉淀里面,估计是包涵体了。那就将沉淀用8M的尿溶解,然后在离心,溶解后的上清在跑电泳,在纯化。纯化完了,在复性。或者可尝试低温诱导,避免包涵体的形成,可以25度诱导试试,祝顺利。
4楼2016-01-18 10:31:39
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