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daijiguo

新虫 (初入文坛)

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专业: 心脑血管药物药理

[求助] 培养原代心肌细胞过程培养液出现浑浊求助已有1人参与

做原代心肌细胞分离培养，已经做过好几次。贴壁24h换液，然后72h再换液，第四天进行实验。
做了大概5、6次后，24h换液后观察细胞已经贴壁，可见波动，再培养一晚上，也就是第3天培养液变浑浊，镜下呈”弥沙状”。细胞状态

差，细胞很瘦。
自己寻找原因：
1、刚开始我以为是感染，将培养箱75%酒精擦了两遍，紫外灯照射一晚上大于12h，同时培养箱中的隔层在超净台紫外灯下照射一晚上，同时水换新消水。然后将前面用的离心管、PBS等全部换新。重复分离过程，至第3天，依然出现培养液变浑浊，镜下呈”弥沙状”。找寻老师来观察，未见感染微生物。
2、配方没有问题。我的培养液配方是：体积50ml（FBS 5ml+MEM 500ul+PS 500ml+L-G 500ml（都是sigma的），其他高糖补足）。这次将已经打开了得那瓶高糖DMEM（hyclone）换了一瓶新的，同时在镜下观察添加剂未见感染。
3、以为是加了L-G才会变化，前面我用了一点以前的L-G，是一直冻在-20℃的，于是配了含L-G和不含L-G的两种培养液给细胞换液，结果还是第3天培养液变浑浊，镜下呈”弥沙状”。细胞状态差，细胞很瘦。所以不是添加了旧的L-G的问题。
4、培养箱会出现CO2 波动，5%-7%这样波动，于是换了另一个稳定5%培养箱。结果还是培养液变浑浊，镜下呈”弥沙状”

。所以不是培养箱co2波动问题。
5、后经过询问师姐，说可能是营养不够。弥沙是细胞代谢产物和细胞死亡了。于是将FBS+10ml ，对细胞进行换液，培养一晚上，观察培养液仍浑浊。所以不是营养不够。
6、培养液PH的问题，测定了D-HANKES液，PH是7.4。高糖培养液也是正常颜色（含酚红）。所以又排出了PH不适的问题

求各位做过原代心肌细胞分离培养的大神们，给予建议。。。我该怎么办，接下来怎么找原因。万分感谢啊啊啊啊

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