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pattondong银虫 (小有名气)
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【重叠pcr及连接问题】 【有效期至2008年11月10日】
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各位大虾 我做连接做了四个月了 到现在还没连上 相当郁闷 请各位高手指点 我的目的片断是一个长约1.2kb的基因，野生型的在一个只能在细胞中表达目的蛋白的载体上，我要做的是一个突变型，突变为点在800多bp处两个相邻的碱基，我用的是重叠pcr，两个短的目的片断（一个为800多，一个为400多）都能p出来，电泳检测大小也对，回收以后以两个短片断做模版再用两头引物p也能p出1.2kb的片断，但是回收这个1.2kb的片断后再用两头引物p却p不出来。如果长短片断不回收，也能p除1.2kb的条带，但是电泳时能看到原始质粒，我怀疑p出的产物有野生型的。但是为什么用回收的长短片断能p出来，再回收以后就跑不出来了呢？ 回收后的完整片断上样3微升能看到条带，不是很亮，我也给模版作了梯度，稀释100倍，稀释10倍，0.5微升，1微升，2微升，4微升，但结果都是只有拖尾没有条带。如果这样p不出来，到后面想用菌落pcr也行不通。 说得比较啰嗦，请各位帮忙，做了这么长时间，一点成就感也没有，真的是很上火啊 [ Last edited by pattondong on 2008-10-3 at 20:27 ] |
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