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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
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虫号: 2315320
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性别: MM
专业: 微生物学

[求助] 毕赤酵母表达疏水蛋白已有1人参与

各位大神好，转眼都要大二下学期了，但是蛋白还是没表达出来，很是焦虑！恳请各位做过毕赤酵母表达蛋白的大神赐教！
我要表达的是真菌当中的一种疏水蛋白，提取了真菌的RNA后反转录，从NCBI中获得该蛋白的CDS区域之后设计引物从cDNA中PCR除了该蛋白的基因序列。
然后去除了它的自身信号肽，将它连到了ppic9k载体和pPICZA中，分别进行胞外和胞内表达，用的是EcoR1和Not1酶切位点。
ppic9k是将片段直接插入到这两个酶切位点，pPICZA中为了防止移码突变在目的片段的终止子后面通过引物设计加入了一个密码子A。
这两个表达载体都通过引物在蛋白的C端加了6XHis标签，然后将表达载体分别用Sal1和Sac1线性化后电转，筛选转化子，
提取酵母基因组鉴定成功后诱导，诱导就是根据诱导手册一步步来，然后跑了SDS-PAGE也做了Western，蛋白胶的话跟对照无差别，但是WB没有做出来，
WB的一抗是his标签抗体，蛋白胶的话蛋白上清和破碎液都做了，都没结果，现在不知道哪里出了问题！！！快焦虑死了！好想退学！！老板天天催！！！
我是真的没有发现哪里有问题啊各位大神！！！为啥别人表达一个蛋白都跟玩儿似的到我这里就这么难！！！
我都做了两遍表达了好多批！就是没有！！！好想退学！！！！！！！
现在有个疑虑就是说表达蛋白的疏水性是不是会影响蛋白的检测，可是查阅文献有表达类似的疏水蛋白也是一样直接取上清进行检测并没有做特殊处理
啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊！！！真的是不会做了啊！！！！！！！！跪求大神来相救！！！！！！！！！！！！

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