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专业: 肿瘤研究体系新技术

[交流] 活体动物体内成像技术的重要综述

活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用灵敏的光学检测仪器，可以直接检测活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这些技术，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、疾病的发生发展、基因的表达及反应等生物学过程。相对于其它活体动物体内成像技术，如超声（Ultrasound）、计算机断层摄影（Computed Tomography ，CT）、核磁共振（Magnetic Resonance Imaging ，MRI）、正电子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET）、单光子衍射(Single-Photon-Emission Computed Tomography, SPECT)等技术，光学成像具有许多独特的优点：操作简便、结果直观、测量快速、灵敏度高及费用低廉等。在刚刚发展起来的几年内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。
活体动物体内光学成像主要的功能是追踪并检测标记细胞在体内的活动及标记基因在体内的表达。这类技术已用于许多领域，具有广泛的适用性。主要来说有以下几个方面：以荧光素酶标记细胞，标记病毒及DNA, 标记基因表达，标记生物大分子及其相互作用，和利用荧光素酶标记的转基因动物模型进行一系列分子生物学和药物在活体动物体内的研究。下面我们详细介绍几个主要方面。
以荧光素酶标记细胞，可以观察标记的细胞在体内的活动和反应。很多常用的肿瘤细胞已被荧光素酶标记。利用皮下，静脉或原位接种后，可实时观察这些细胞在体内的生长，转移，以及对药物的反应。因为这个技术的灵敏度能观察到100个左右的细胞，可以在其与周围正常组织无明显形态学变化时，就可通过光学成像进行识别，灵敏地观察到微小的转移灶。应用其准确的定量性能和功能成像特性，根据发光强度判断肿瘤的进程，可以直接快速测量肿瘤的生长和转移。许多欧美的药物研发机构，制药公司和生物技术公司都利用这个技术的研究结果作为其FDA药物报批中很重要的一部分。
用同样方法标记免疫细胞和干细胞，可以观察这些细胞在体内的活动。现行的骨髓移植技术通常检测供体造血干细胞在受体骨髓中的数目，是一种终点检测方法。应用转基因鼠，将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可以通过生物发光实时检测这些干细胞的后代在动物体内的生长和活动。免疫细胞可以用一般的细胞转染方式标记，干细胞标记需要通过Lentivirus或转基因动物来实现。这方面的技术已用于研究干细胞移植，肿瘤免疫，毒血症，风湿性关节炎，皮炎[28]等发病机制，也用来评价T细胞的免疫特异性，增殖、迁移及功能等。
荧光素酶也可以用来标记病毒及其他DNA分子，例如siRNA等。大量的文章也将活体动物成像技术应用于基因治疗的研究中。因为基因治疗主要是以病毒做载体，将荧光素酶基因作为报告基因加入载体，可观察目的基因是否到达动物体内的特异组织和是否持续高效表达。发表的文章有腺病毒，腺相关病毒AAV2及AAV5，Sindbis, CMV, HPV等等。这种非侵入方式可以直接，实时地观察到这些病毒或载体在动物体内的侵染和活动，了解到用其他方法无法看到的一些病毒侵染部位和时域信息。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况。将靶基因以荧光素酶标记，McCaffrey 等成功应用siRNA及shRNA减弱了小鼠转染的荧光素酶的表达，第一次在活体动物体内实时观察到siRNA对特异靶基因表达的阻断作用。
将感兴趣基因的启动因子与荧光素酶相连接，并将其稳定整合到染色体中，与这个基因平行表达，构建出将此基因光学标记的转基因动物。通过这种方法，可以直接观察这个基因表达的数量，时间，部位、和影响其表达的因素。这些动物模型已大量用于病理研究，药物研发和药物筛选等领域中。例如，Zhang等构建的转基因鼠(iNos-luc)，研究可诱导的NO合成酶(iNOS)在急慢性免疫反应中的作用，并以此对多种化合物进行了抗免疫反应的测试和筛选。另外构建的VGEF2启动子控制的Luc转基因鼠，用来研究创伤恢复和肿瘤血管生成。他们还构建了由神经胶质纤维蛋白GFAP启动子引导的Luc转基因鼠，用来研究神经损伤及老年痴呆综合症（Alzheimer Disease）。另外，一系列药物代谢酶（如p450）启动子控制的Luc转基因动物在药代动力学及毒理研究方面也开始发挥作用，成为研究药物作用机制及药效的重要方法。
最近，将活体动物成像技术应用于蛋白蛋白相互作用及细胞凋亡的研究取得了很大进展。 Paulmurugan等将胰岛素样生长因子II (IGF-II)与胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP-6)分别用GFP及Renilla荧光素酶基因融合，研究它们之间在活体动物体内的相互作用。另一种观察活体动物体内两种蛋白质相互作用的原理是将荧光素酶基因分成两段，分别连接上所研究的两种蛋白基因。当这两种研究的蛋白相互作用时，荧光素酶的两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光。此方法亦被用于研究细胞信号传导等。

综述文献见附件。

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