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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有老师做过infusion么？看看我的片段，能分享点经验么？先谢谢啦
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疯子J-F

木虫 (著名写手)

[求助] 有老师做过infusion么？看看我的片段，能分享点经验么？先谢谢啦 已有3人参与

下面是我的片段回收图(3μl)，最前面的是载体，后三个是目的基因，连了两次没有连上呢。。。

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1楼 2016-01-07 20:46:17
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
疯子J-F: 金币+2, ★有帮助 2016-01-07 23:56:48
拿过来，我帮你做。so easy  暂时不清楚你什么问题，不好回你。

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2楼2016-01-07 23:49:27
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tuodecai at 2016-01-07 23:49:27
拿过来，我帮你做。so easy  暂时不清楚你什么问题，不好回你。

海南呀，不去，太远了，就是连不上，引物啥的都没问题的，能是比例的问题么

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3楼2016-01-07 23:56:17
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同源臂是否是20个碱基左右？
同源重组时应保证各片段分子数为1:1，
多片段的重组本身效率就比较低，在转化后需要多挑几个单克隆验证。
另外您可以通过重叠PCR将三个基因片段先连到一起，然后跟质粒进行重组。

您的质粒如何线性化的？建议使用高保真酶进行反向PCR扩增，模板尽量少一点，保证没有环状质粒混入到重组体系中。
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疯子J-F
4楼2016-01-08 14:16:57
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zzhjiangnan

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

同源区只要有一个碱基对应不上，那就很可能做不出来了。仔细检查引物设计是否正确。
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5楼2016-01-11 08:57:47
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zzhjiangnan at 2016-01-11 08:57:47
同源区只要有一个碱基对应不上，那就很可能做不出来了。仔细检查引物设计是否正确。

嗯嗯好的，谢谢老师

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6楼2016-01-11 09:08:05
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疯子J-F

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-08 14:16:57
同源臂是否是20个碱基左右？
同源重组时应保证各片段分子数为1:1，
多片段的重组本身效率就比较低，在转化后需要多挑几个单克隆验证。
另外您可以通过重叠PCR将三个基因片段先连到一起，然后跟质粒进行重组。
...

质粒是双酶切的，现在在做重叠pcr了，有两段已经连上了，还有一段，谢谢分享经验

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7楼2016-01-11 09:11:15
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