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求教土壤蛋白酶测定过程中的一些问题？
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用的是“蔡红，沈仁方”的改良茚三酮法，有所改动，称取的土壤由5g改变为0.2g，酪酸钠没有用干酪素配制，而是直接用，方法如下： 2 .3 标准曲线的绘制 分别吸取50 、100 、150 、200 、250 、300 μl 0 .01 %甘氨酸标准溶液, 置于10 ml 刻度试管中(浓度分别相 当于NH2 0 .107 、0 .213 、0 .320 、0 .426 、0 .533 、0 .639 μgml-1), 加入2 ml pH5 .8 的乙酸—乙酸钠缓冲溶液,再加入1 .5 ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂, 混合均匀, 沸水浴加热16 min , 取出立即用自来水冷却15 min , 加入1 ml 0 .2 %KIO3 并混合均匀, 用蒸馏水定容至10 ml , 1 h 内在570 nm 处比色测定吸光值(本次试验使用了TU-1800 紫外可见分光光度计, 北京普仪)。以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标, 吸光值 为纵坐标, 绘制标准曲线。 2 .4 培养与测定 称取0.2g 土壤, 加入2 ml Tris —HCl —CaCl2 混合溶液和1 ml 甲苯, 混合均匀后静置15 min 以抑制微生物活性, 然后再加入5 ml 2 %的酪酸钠溶液, 50 ℃振荡培养2 h 。对照土壤在培养过程中不加酪酸钠溶液, 但在培养结束后加入, 且加入的酪酸钠也经历50 ℃、2 h 的振荡培养过程。培养结束并在对照中加入酪酸钠后, 充分混合,置于0 ～ 4 ℃冷藏柜中静置30 min 。取出加入1 .5 ml 0 .6 mol L-1乙酸铅溶液, 6000 g 离心10 min , 取上清液1.5ml , 加入457 μl 草酸钠—乙酸混合溶液,17 000 g 再离心10 min , 小心吸取1 ml 上清液, 按照绘制标准曲线的办法测定吸光值。 每个土样设置3 个重复。 问题如下： 1）方法中使用的酪酸钠，要求用干酪素进行配制风干后得到，我们的实验中，直接用酪酸钠称取2g进行，是否有影响？ 2）方法中有一个乙酸铅的药品，直接用水加热溶解，会形成水解物，为浑浊，于是加入了些许乙酸，进行溶解，再加水，为清澈液体，加入的乙酸会不会对结果有影响？ 3）处理完的试剂为茶色或土黄色，并不是蓝紫色，测到的结果为正值，但如果减去空白，得到的则为负值，这是合理的么？ |
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酪酸钠的制备:将市售干酪素溶于1 %Na2CO3 溶液,并用醋酸使溶液酸化至pH4 .0 , 使蛋白质沉淀下来。用冷水将沉淀小心洗涤至中性, 再用1∶1 的乙醇—乙醚混合物处理, 在通风橱里风干 。冷冻保存。 2 %酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠, 加入10ml 0 .1mol L-1的NaOH 溶液, 沸水浴处理5 min , 待膨化后加入pH7 .6 的tris —HCl 缓冲液约80 ml , 继续沸水浴处理, 直至完全溶解, 用同样的缓冲液定容至100ml 。 按照以上方法，溶解的干酪素，制备成酪酸钠，再配成酪酸钠溶液的。完全参考蔡红、沈仁方2005年的方法，已经制备成功 |
3楼2016-01-21 11:47:03
