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Tricine—SDS—PAGE电泳分析小分子多肽 已有2人参与
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物质的相对分子质量范围在 10～200 kDa，对于相对分子质量小于 10kDa的多肽分辨率低uJ。Swank等在含有 SDS的凝胶中加人 8mol·LI1的脲，但分离效果不甚理想，且重 现性较差。Lanzilo等发现在Laemmli系统和仅在样品和电极缓冲液中有 SDS的不连续缓冲系统中，低分子量多肽常常堆积在浓缩胶中【2l，之后 Scba~ r等【3]又进行 了系统地研究和探索，能够分离较大相对分子质量范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定技术极为重要。本文报道采用 Tris．Tricine缓冲体系，对 SDS-PAGE方法的各个 环节进行了改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了较理想的结果。 1 材料和方法 1．1 试剂和仪器 SDS为华美生物工程公司产品；丙烯酰胺 (分析 纯)为上海绿鸟科技发展有限公司产品；N—N’甲叉 双丙烯酰胺 (分 析纯 )为 Fluka公 司产品；Tris为 PI'咖e 公司产品；Tricine、TEMED、过硫酸铵均为上 海生工 AMRKSCO分装产 品；脲 (分 析纯)为无锡市 民丰试剂厂产品 ；肽分子量标准 的分子量范围1060 ～ 266OO为美国 Sigma公司产品。EPS604稳压稳流 电泳仪(南京科宝仪器研究所)；小型垂直电泳附件1．2．2 胶的制备 在垂直电泳附件模具中，按表 3给 出的数据依次灌注分离胶、间隙胶和浓缩胶，采用 4种不同的分 离胶配比方法，进行 比较实验。 1．2．3 电泳 分别按表 1的组 成加阳极及阴极缓冲液，先 60V电泳 1h，当样品进人分离胶时，将实验的电压 分别升到 100V，85V，95V，95 V进行 比较，直至样 品中染料迁移至离下端 1cm时停止. 多肽 取出平板中的凝胶立即浸泡于固定液 (50％乙醇，10％冰 乙酸 )中固定 1h，再将 固定后的凝胶置于45℃的染色液 (1g·L 考马斯亮蓝 R-250的 25％乙醇，8％冰乙酸 )中浸泡 l5～30min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次，最后，多次变换脱色液(25％乙醇，8％冰乙酸，以上均为体积分数)，直至凝胶上背景脱净为 I七。 2 结果和讨论 4种不同类型胶的蛋白标准分离结果如图 1。对后两种类型胶的分离结果以其 w对数 (1gMw)和在分离胶中的相对迁移率( ，)进行了直线回归分析(图 2)，相关 系数 r分别为 0．896和 0．892。 多肽合成 由图 1可 以看出，分离胶 0．1T，3％C的 SDS-PAGE电泳可以分析分辨 5kDa以上的蛋白，该类型的胶相对于其它类型胶来说产生的热量较小，但是低于5000Da的多肽很难分辨。分离胶．0．165T，3％C图 1 4种不同类型胶分离标准蛋白的 SDS-PAGE可 比较清楚地分离 3kDa以上的多肽，而 1kDa相近的蛋白带无法观察，若低于5000Da的多肽分离不很重要的话，完全可以省去间隙胶的使用；分离胶 0．165T，6％C(不 含脲 )的 SDS-PAGE电泳对于 1～20kDa的多肽有很好的分辨率。在第 4种类型的分离胶中添加脲，如 Swank和 Munkres所述，低于5000Da的蛋白条带清晰度增加。脲使用 与否的主要区别在于蛋白的具体性质，有些蛋白没有脲时分离效果更好，但是有些蛋白的分离就需要 子多肽的扩散、丢失。在含 SDS缓冲液 的样品中， 添加脲时才能更好分辨。但在一般小分子肽的分离 小分子多肽的浓缩是较困难的 ，因为小分子多肽与 中，有无脲的添加对电泳结果无明显影响。根据相 SDS形成的复合体具有与 SDS本身类似的电荷和大 对迁移率与标准蛋白相对分子质量对数的曲线 (图 小，因此浓缩对于小分子多肽的 SDS-PAGE来说就 2)可见，5种蛋白的计算相对分子质量精确度为 成了一个突出的问题【4J。 多肽合成图片 多肽合成图片1 我们采用的方法中利用 ±10％，属于电泳法测定相对分子质量的正常误差 Tficme缓冲体系，分离胶和浓缩胶中采用相同的 pH 范围。仅有最低相对分子质量标准蛋白( l06o) 值，并在较低的丙烯酰胺浓度的电泳条件下，使小分的计算值与实际相对分子质量有一定差异，这主要是因为小肽的相对分子质量越小，其固有电荷及其构象对泳动率的影响就越大。以上结果表明该法在实际工作中可为研究者提供较为可靠的分离条件及分析结果。SDS-PAGE电泳的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，相对分子质量低 于10000的小分子肽即使用较高浓度的聚丙烯酰胺也不能完全分离。我们通过比较发现，采用分离胶 0．165T，6％C(含或不含脲 )的梯度胶电泳 ，即可把标准品的6条带显示得非常清楚，上样量小，重复性好。固定、染色和脱色过程中未使用甲醇，且在电泳后通过加热速染色避免了凝胶的膨胀变形，而且 甲醇会使sDS_蛋白复合体中的 SDS游离出来而导致一些小分子多肽能够有效地压缩和去压缩。而且电泳体系中不使用甘氨酸和脲，可以为后来的氨基酸序列测定免除干扰。 原文地址：ontores-新浪博客 |
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