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wordsworth3180木虫 (正式写手)
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重组质粒鉴定的难题，大家帮帮忙
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最近一直在做重组质粒却不太顺利 我的质粒双酶切下去83bp 而pcr产物178bp 引物上设计的酶切位点 有6个保护碱基 请问这个载体和目的基因双酶切之后是不是跑电泳都看不到切下的条带呀？ 那怎么验证是否切开呢？难道要直接连接转化，跳重组子才能鉴定? 心里没底呀！ 大家有没有什么好主意呢？ 我是新手，没啥金币，还是希望给些好的建议 下图右边四个分别是：两个单酶切质粒、双酶切质粒和未酶切的质粒 看不出啥不同亚？ |
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2楼2008-09-23 00:33:43
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3楼2008-09-23 16:19:47
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1，质粒双酶切下去83bp ，骨架一般在3K以上，83bp的条带电泳看不到，因为片段太小，所以你无法通过电泳来鉴定两个酶切位点都切开了。 2，178bp的产物 电泳更无法鉴定两个酶切位点都切完全了。 措施： 1，载体用两个酶依次切，为了提高克隆效率，可以去磷酸化处理 2，PCR产物先克隆到T载体，T载体一般2.9K, 然后切和回收178bp，要点技术，完全可以做到你后续克隆所需的量。酶切的量加大，回收胶用长孔。我们试验中经常克隆100bp左右的片段。直接酶切PCR产物的问题是无法保证两个点都切完全了。 （还有处理载体的办法，但是你的克隆量不大就没必要了，我们试验中这种小片段克隆有一两百个，所以整个过程控制就很重要了，从载体的酶切到PCR片段的消化，以及克隆子的检测） |
4楼2008-09-23 22:12:42
wordsworth3180
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7楼2008-09-24 19:30:49
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8楼2008-10-05 16:54:51