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反相液相色谱在多肽及蛋白质分离分析中的应用
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RPLC 的一个主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和分析。对于分子结构比较简单的多肽和某些蛋白质 ,在不影响产物的活性或产物在 RPLC 后很容易重新折叠复性的前提下 ,用 RPLC 进行纯化制备是一项高效的手段。同时 ,RPLC 分辨率高和重复性好的特点 ,使它在蛋白质及多肽分析领域占据核心地位。尽管在 RPLC 中有机溶剂的存在及疏水固定相的影响可能导致蛋白质三维结构的改变 ,但这对分析鉴定并不重要 ,虽然被分析的蛋白质发生了变性 ,却能够给出该蛋白质的结构特征及疏水性等信息 ,并将其精确地与其它蛋白质相区分。 3. 1 多肽及蛋白质纯化RPLC 可用于绝大多数的多肽纯化。RPLC 流动相以水为基本组成部分 ,与肽的生物学性质相适应 ,虽然流动相中的酸、有机溶剂以及固定相均可能使肽的天然构象发生变化 ,但当这些因素除去后 ,肽的构象一般能恢复原状 ,因此在 RPLC 中 ,肽的回收率一般在 80 %以上。早在 1986 年 ,人们就用 RPLC 对神经肽进行了纯化。Boyes 等也报道了用连续 RPLC 对细菌原液中的重组人淀粉状蛋白前体多肽片 段进行分离 。与分子量小、空间折叠相对简单的多肽相比 ,蛋白质的 RPLC 分离经常存在一些问题。蛋白质分子量一般都在万级以上 ,很多有亚基结构 ,立体构型及构象复杂 ,与流动相、固定相及样品中的其它成分以及蛋白质本身都可能存在多种复杂的相互作用 ,会造成谱带扩散、峰形拖尾等问题 ,甚至发生变性和不可逆吸附 ,引起回收率和分辨率的降低。因此 ,随着蛋白质体积和疏水性的增加纯化难度也会增加。但是 ,选用适当的操作条件 ,也可用 RPLC 对某些蛋白质进行纯化。核糖体蛋白的纯化就是其中一个具有代表性的例子 。近年来 ,关于多肽及蛋白质的 RPLC 纯化也取得了许多成功 ,如 Krusa 等用 RPLC 对大豆蛋白进行了 纯化和定量分析 ,其它一些应用的实例见。 3. 2 肽图阐明蛋白质的结构、功能 ,对蛋白质进行深入研究都离不开对其一级结构、修饰位点等的了解。在蛋白水解酶(如胰蛋白酶) 或化学试剂(如溴化氰) 作用下 ,蛋白质可被部分裂解 ,RPLC 对肽段混和物可进行有效分离。在这一过程中所获得的反相色谱图即称为该蛋白质的“肽图”。肽图法已成为 RPLC 在蛋白质及多肽分析中最重要、最广泛的应用 ,已用于重组蛋白质量控制、疾病诊断等诸多领域。 表 1 RPLC 纯度多肽及蛋白举 反相肽图中常采用 C18柱,由于酶消化产物含有大量疏水性各不相同的肽段,因此多采用较窄的梯 度并延长梯度时间。由于蛋白质酶解产物中肽段分子量通常较小,借助反相肽图进行蛋白质及多肽分析可得到重复性好、分辨力高的结果 ,已有多种多肽及蛋白质用 RPLC 进行了肽图分析,见表 2 这其中既包括人生长激素、人粒细胞集落刺激因子这样的重要药物蛋白 ,也包括聚乙二醇 - 人生长激素这样的蛋白质修饰产物。肽图分析有利于确定产物的一维结构 ,并有可能确定修饰位点。 3. 2. 1 蛋白质序列分析 这是肽图分析的重要应用之一。肽图上各峰经氨基酸分析并结合 Edman 降解或电喷雾质谱等手段 ,可得到每一肽段的精确序列。如Moritz 等用 RPLC 对单克隆抗体A33 进行了序 列测定[3质谱技术的发展 ,反相肽图结合串联质谱已成为一种方便、快捷的序列测定方法 ,用于与蛋白质数据库相结合进行分析 ,反相肽图还可对未知蛋白进行定。 3. 2. 2 分析蛋白质的细微结构差异 天然蛋白质的色谱通常无法反映蛋白质组成上的细微不同,而RPLC 以其在揭示蛋白质结构细微差异上有出色的表现 ,即使一个氨基酸的改变也可通过相应肽段保留时间的变化清楚反映出来。例如 ,肽段上脱酰胺作用常常引起保留时间的轻微延长 ,而氧化产物如甲硫氨酸亚砜或半胱磺酸的形成常引起保留时间的显著下降。同样 ,变异蛋白质的形成也会引起一个或多个肽段保留时间的变化。 3. 2. 3 蛋白质修饰分析 随着人们对蛋白质修饰的研究不断深入 ,RPLC 不仅被用来分离修饰与未修 饰产物 ,在修饰产物分析上也得到了很好应用。蛋白质修饰包括蛋白质在体内的翻译后修饰如形成 N2甲酸基或 N2乙酰基衍生物进行 N 端封闭;形成氨基化物进行 C 端封闭; Ser 、Thr 、Tyr 等含羟基的氨基酸 磷酸化 , Asn 的 N2糖基化及 Ser 、Thr 的 O2糖基化。还包括人工化学修饰如聚乙二醇、葡聚糖修饰等。借助 RPLC 可阐明修饰的位点及其化学本质。由于糖肽在 RPLC 中的保留行为与其糖基化水平密切相关 ,糖基化程度越高 ,保留时间越短,因此可将糖蛋白水解成肽段后进行反相色谱分析 ,从而得到糖基化水平及所处肽段。Huddleston 等专门讨 论了糖基化的定性分析。同样 ,磷酸化蛋白质中连接磷酸基的数量、位置等也可从 RPLC 分析中得出。无论是翻译后修饰还是化学修饰 ,修饰位点的测定多采用对蛋白质作肽图后经比较确定被修饰的 肽段 ,再结合质谱分析得到精确位点 ,这方面已做了许多有意义的工作。Ogueta 等就利用 RPLC 和离子阱质谱对两种蛋白的磷酸化位点进行了分析 ,得到了很好的结果。这一方法也可用于化学交联蛋白 质分析 ,如交联 RNase A 中的交联位点。该分析方法还可用于蛋白质活性位点及结合位点等的鉴 定。但在有些蛋白质的大分子修饰位点判断中 ,修饰上的分子对酶解及肽段分离的影响会对分析造 成困难。 3. 3 酶活测定随着 RPLC 在临床及生物医药中广泛地应用 ,人们开始利用它来检测体内特定酶的活性。酶活性测定多采取分光光度法 ,但这种方法需要所测样品达到一定纯度。RPLC 可经特异监控底物及产物浓度直接测量体液和组织中的酶活性 ,具有特异性强、简便快速的优点。通常将样品加入合适底物 ,通过加热、加酸或加入特定抑制剂终止反应 ,用反相液相色谱测定底物或产物浓度的改变并计算出酶活性 ,也可直接从活体的体液中底物或产物浓度变化来监测酶活性。另外 ,由于 RPLC 可精确测定肽段的磷酸 化 ,也有人将其用于酪氨酸激酶的活性测定。Hartwick 等 曾通过 RPLC 监测腺苷的浓度来确定红血球中腺苷脱氨酶的活性 ,还借助 RPLC 成功地测定了 3′AMP 合成酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、黄嘌呤氧化酶等的活性 ,表现出 RPLC 在这一 领域的巨大潜力。 3. 4 检测蛋白质构象改变RPLC 应用中的另一个重要方面是对多肽和蛋白质的不同构象中间体及其之间相互转变的研究 ,这方面已有大量工作 , 如对胰岛素 、溶菌酶 、重组生长因子和 N 甲基重组生长因子 及细胞z素C等多种蛋白质及多肽在 RPLC 的疏水环境中构象变化的研究。这些研究的共同特征是蛋白质和多肽的吸附和解吸附与溶剂或配基引起的构象改变有关。蛋白在 RPLC 固定相上的保留行为是基于蛋白质与固定相配基间的非特异性疏水相互作用 ,这种疏水作用力的强弱与蛋白质的结构尤其与蛋白质疏水基团的暴露程度有着密切的关系。它不仅取决于蛋白质的氨基酸序列 ,更取决于蛋白质与固定相发生作用时特定的空间构象。不同条件下 ,由于蛋白质构象变化会导致蛋白质疏水基团发生不同程度的暴露 ,与固定相配基作用的位点也随之变化 ,从而在 RPLC 中反 映出色谱行为的改变。因此 ,可以利用 RPLC 来分析蛋白质分子表面疏水性和空间构象的稳定性重组蛋白的测序。如果酶解过程中控制条件使二硫键不被破坏 ,通过比较二硫键还原前后的肽图即可 判断二硫键的位置。Cunsolo 即用上述方法对一种花粉蛋白中某肽段二硫键的位置进行了表征 。如如果蛋白质或多肽的空间构象比较稳定 ,那么在各种不同的色谱条件下 ,蛋白质与配基的结合位点不容易改变 ,保留机制不变。反之 ,因空间构象的变化 ,就有可能采用不同的保留机制。这为测定构象中间体转变过程的动力学及热动力学提供了直接手段。RPLC 在蛋白质构象改变研究中的应用已表现出巨大潜力。Kumar 等使用 RPLC 证明了 RNase A 经三氯乙酸处理后构象的改变 。还有人通过用 RPLC 分离变化过程中的各种折叠中间体 ,动态监测了牛胰岛素在二硫苏糖醇作用下去折叠的过程 。另外 ,Mccrossin 等还通过 RPLC 分离和肽图分析相结合检测了盐酸胍存在下猪生长激素的降解情况。随着反相材料和检测手段的发展 ,RPLC 在蛋白质构象行为研究中的潜力已被越来越多的人们所认识。 原文地址：ontores-新浪博客 |
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