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核酸抽提的基础现状--理论与实践结合的好文章
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核酸抽提的基础现状 作者：佚名 这些天在思考如何改进提DNA时在网上发现的一篇关于核酸抽提的好文章，以前的一些疑惑都在其中找到了答案，大家也可以学习学习 近日撰写了一个关于核酸抽提的基础现状的草稿；没有去找参考书润色，所以会有点凌乱。首先声明的是：这篇东西只为有一定核酸抽提基础知识的人准备，同时也将会及时修改。那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思维有点跳跃，二则是没有必要糟蹋自己的时间。 写这篇东西的另外一个原因是，我一直在思考如何简化经典的无介质的核酸抽提程序。最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸沉淀一步；DNAzol 将这三步并成了一步，按道理已经简化到了极致。事实是，DNAzol 并没有被大家认可，其原因大概还是质量不太可靠吧。现在也有使用Proteinase K 消化后直接沉淀核酸的方法，三步简化成了两步，可我总觉得醇的沉淀不可能彻底去除 Proteinase K。明年大概还没有生物学的诺贝尔奖会花落中国的，那么先求得一个核酸抽提最简单的非介质方法世界领先如何？一笑！也一定。 1、核酸抽提原理 简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。 经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl 等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如 NaCl）等。去污剂则是通过 及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如 GIT、GuHCl 等）裂解的，该方法已经成为了RNA 抽提的主流，却不是基因组DNA 抽提的主流。 最常用的纯化方法，一是PC 抽提+ 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR。其它杂质-如多糖、多酚等的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。 2、裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法，仍然可以认为是抽提基因组DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组DNA 与蛋白质“缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组DNA 的特性占优势，则纯化时以DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致DNA 的损失。另外，象有些样品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。 高浓度蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl 等） 的裂解方法，是抽提RNA 的首选。总RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，并且能迅速抑制住细胞内的RNA 酶，从而确保了RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品-主要是植物，其它绝大部分样品的RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。 不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用PC 抽提的差一些。 SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。该方法不一定要使用PC 纯化，但结合PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。 PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制PCR 反应杂质的东西，如Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是否是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着PCR 的抑制物量的降低。 含CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB，批号不同，效果就可以差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。 3、纯化方法评价 PC 抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品（杂质为蛋白质），该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次PC 抽提都会损失一部分核酸（因为不可能将水相全部移取），以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。 高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度（蛋白质残留）不够稳定。 介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高（虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高）。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状（如 Glassmilk、磁性小珠等）。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力（不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留）。不过，介质纯化方法的成本是最高的。 4、醇的沉淀 醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质—主要是盐—的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。 就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来（当然，得率可能会降低）。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题—主要是纯度问题—时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。 如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个方面综合考虑，则建议：少量核酸用异丙醇沉淀（量少，洗涤不是问题，不丢失为先），大量核酸用乙醇沉淀（量大，丢失不是问题，洗涤方便为先）。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过（我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀？）；我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。 当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。 PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀RNA 以去除DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。 5、洗涤 洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时（使核酸沉淀最终蓬松）；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一描述本身没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了“水土不服”的问题。如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。唯一不受管子质量影响的操作，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。一定要牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。 另外，核酸沉淀的大小也决定了洗涤的强度。沉淀越大，放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。 6、核酸质量的检测问题 将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光广度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大（超出电泳分离范围），该方法还是非常可信的；另外，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光广度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光广度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更准确的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。 7、PC 抽提 PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会对部分打断大分子的基因组DNA，但该破坏作用不会强烈到DNA 变成10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组DNA 的片段，大部分会大于20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀—此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。 8、样品与裂解液的比例 起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提100mg 样品，就一定使用100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果（纯度及得率）没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。 9、蛋白质是如何残留的 PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量PC 中含有的蛋白质。 高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。 介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。 10、小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的 醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。 介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。  [ Last edited by ntill on 2008-9-21 at 14:24 ] |
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 实验技术 | CRISPR Cas Systems |
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接上面.... 11、标准化的概念 所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。标准化并不是以获得最高质量为目标，而是以稳定为目标。标准化的核心是质控。 事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或者现象作为参考，从而确保实验的成功。如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时Tip 的尖头尽可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下1mm 以上的液体不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。洗涤的核心是彻底悬浮沉淀，并且要放置一段时间（时间长短与沉淀大小有关）使沉淀内部也能被洗涤到。按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。 柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。一般而言，柱式操作出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。这一点，应该是可以理解的。 一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。步骤越少，标准化就越容易。产品的开发也要以高标准化程度为目标。 12、QC 的概念 QC 概念远没有QT 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检，或者是Trouble-free。另外，现在的许多产品也是不允许QT 的（因为是一次性的），因此就只能靠QC 来保证质量了。QC 是将精力集中在过程中：原料、操作等。只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们有意无意之中非常的注意QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention to QC，只知道最后的QT。一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。如果QC 做得好，最后的QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。 13、EP 管的问题 几乎没有人会认为EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象（如核酸在-20℃ 保存一天后发生了降解）有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。 硅化可以提供最高质量的EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。 我个人认为，只有硅化过的EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。 14、核酸抽提中的温度问题 核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止降解”之类的理由，并没有多少可信度的。 15、如何阅读操作手册 拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和By the Way 之类的话中含有真正的有用素材。 16、其它 核酸抽提的每一步操作，都是利弊权衡的结果。消化要彻底，时间就会长；PC 抽提时多取上清，得率会提高，但增加了蛋白质污染的风险；沉淀使用低温且时间长，得率会提高，但增加了杂质污染的风险 … 不足详列。总之，核酸抽提是艺术，可以根据自己的样品及当时的情况，对操作步骤进行适当的优化。 17、实验的思维 核酸抽提的成功，就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏，而是告诉你做实验的良好思维。就如同小学基础没有打好，早晚会发现大问题一样，做实验决不要以成功为喜悦，以失败为痛苦。要保证实验成功，绝对不能有“这个操作应该没有问题”，“用这个可能不会有问题”之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实验失败的因素，这才是实验该有的出发点。用这样的出发点，实验几乎没有不成功的，所以说，实验成功没有什么快乐；实验的快乐来自于：发现自认为不会导致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识，才有快乐的理由。 18、EB 在NA 抽提中的运用 EB 在NA 抽提中的应用，用于电泳，人皆尽知；用于gDNA 抽提时提高蛋白质与gDNA 的分离效率，却似乎没有人再考虑了，因为大家都怕使用EB。在 NA 抽提中涉及到EB 的另外一大类，就是胶回收操作了；EB 在胶回收中扮演的角色，就不完全是正面的。 如果NA 与EB 充分接触，EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入NA 之中。EB 的这种插入，无疑更可能破坏核酸双链的稳定性，使核酸由双链变成单链的压力增加。如果核酸比较短，而错配又多（错配的后果之一也是核酸容易由双链变成单链），EB 的插入将更容易导致的出现。这个观点有如下的实验报告佐证：有相当部分的PCR 产物胶回收实验，都报告说回收后的电泳结果是：目的条带变淡或者消失，同时出现了一条小的原来不存在的条带。 坛中曾有文描述他做胶回收的程序：两边加Marker，中间加产物；电泳过程不含EB。电泳结束后，纵向割下Marker 条带用EB 染色后，放回胶原来的位置。开紫外，根据Marker 的位置割下目的条带，再回收。这是个笨办法，但这样使用的人一定是聪明人。 19、核酸的保存 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现，-20℃保存的DNA 比-70℃保存的稳定，我却宁可认为这是个例。 如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解。还有一个不为人重视的，就是EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能媳妇核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入Geletin、Glycogen、BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。 现在制造EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型 |
2楼2008-09-21 14:20:37
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