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岳大白

新虫 (初入文坛)

[求助] SOE–PCR做基因敲除,新手求指教。 已有1人参与

上下游同源臂,和中间的抗性基因已经得到,目前遇到的问题是三个基因混合,PCR时链接不上,到底是哪里的问题呢?我用的primer star max 酶,引物设计时有15bp的overlap,三个基因的混合比例也试过几次。

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Heao_

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
1楼: Originally posted by 岳大白 at 2015-12-01 10:36:44
上下游同源臂,和中间的抗性基因已经得到,目前遇到的问题是三个基因混合,PCR时链接不上,到底是哪里的问题呢?我用的primer star max 酶,引物设计时有15bp的overlap,三个基因的混合比例也试过几次。
...

PCR最好用三步法,前几次的退火温度要低一些。

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2楼2015-12-01 16:29:26
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biosci

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同源臂加长到25bp,另外无引物过夜处理,然后再PCR
3楼2015-12-01 16:54:16
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岳大白

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2015-12-01 16:54:16
同源臂加长到25bp,另外无引物过夜处理,然后再PCR

怎么过夜处理?什么条件呢?

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4楼2015-12-01 16:57:17
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