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yechao0911

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[交流] 江南大学刘立明实验室横向项目推广

实验室横向项目推广
主要项目
微生物发酵生产丙酮酸的关键技术 2
发酵法生产乙偶姻的关键技术 2
微生物发酵生产阿卡波糖的关键技术 3
微生物发酵生产异维生素C的关键技术 4
微生物转化生产α-酮戊二酸的关键技术 4
微生物转化生产L-鸟氨酸的关键技术 5
酶法转化生产维生素C磷酸酯钠的关键技术 6
酶催化合成医药中间体关键技术 7
微生物转化生产L-瓜氨酸的关键技术 7

项目联系人：刘立明教授
地址：江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品科学与技术国家重点实验室四楼
电话：0510-85197357
传真：0510-85197875
E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn
微生物发酵生产丙酮酸的关键技术
产品概况
丙酮酸是一种重要的有机酸，广泛应用于制药、日化、农用化学品和食品等工业中，目前工业级丙酮酸国内价格为5万元/吨，全球丙酮酸市场需求共24000吨。丙酮酸的工业生产方法主要有酒石酸合成法和乳酸氧化法，工艺具有污染重、成本高等缺点，严重制约着着我国丙酮酸产业的可持续发展。微生物发酵法生产丙酮酸具有低成本、高质量等优势。
技术性能指标
本研究室在自行选育的四重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCC M202019的基础上，从代谢能力、鲁棒特性和环境适应性等入手，阐释了影响T. glabrata高效积累丙酮酸的关键因素。实践了全局高效调控光滑球拟酵母代谢功能的新方法，在30 L发酵罐中：发酵时间60 h，丙酮酸浓度70.9 g/L，葡萄糖转化率为0.61 g/g，生产强度为1.18 g/(L•h)，Para-Pyruvate/Pyr < 1.4 %。
发酵法生产乙偶姻的关键技术
产品概况
作为一种具有令人愉快的香味物质，乙偶姻广泛应用于食品、制药、化工等领域。微生物发酵法因具有生产效率高、原料来源广泛、生产成本低、环境污染较小，产品纯度可视为纯天然等优点，引起研究者的关注，具有广大的应用前景。
技术性能指标
本研究利用高通量筛选策略，从土壤中筛选获得高产乙偶姻的菌株Bacillus amyloliquefaciens FMME044，在最优培养基条件下，乙偶姻产量为48.6 g/L。在分析该菌株生理特性的基础上，提出了有效地发酵过程优化策略，同时通过基于连续培养的适应性进化工程，获得一株耐受高浓度乙偶姻的突变菌株，发酵40 h乙偶姻产量达到70 g/L。
微生物发酵生产阿卡波糖的关键技术
产品概况
作为一种具有令人愉快的香味物质，乙偶姻广泛应用于食品、制药、化工等领域。微生物发酵法因具有生产效率高、原料来源广泛、生产成本低、环境污染较小，产品纯度可视为纯天然等优点，引起研究者的关注，具有广大的应用前景。
由于我国人口众多，并伴随城市化进程加快而导致的饮食结构改变和运动量减少等不健康生活方式，预计到2020年我国的糖尿病患者将会翻一番，对降糖类药物的需求量日益上升。阿卡波糖作为临床常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂，在治疗糖尿病方面具有良好的药代动力学性质和低毒性，属于II型糖尿病的常用药物之一。阿卡波糖目前生产水平为6.6 g/L，市场价格为4000元/kg。
技术性能指标
目前工业生产所用菌株合成阿卡波糖的基因簇已经基本清晰，可以借助构建基因组规模代谢网络模型解析阿卡波糖合成途径来达到提高其产量的目的。500 mL摇瓶指标为：发酵培养160 h，阿卡波糖浓度达到3.2 g/L，对细胞得率为0.26 g/g，生产强度为16.7 mg/(L▪h)。
微生物发酵生产异维生素C的关键技术
产品概况
  D-异抗坏血酸作为维生素C的光学异构体，具有抗氧化作用强、氧化速度慢等优点，广泛应用于食品、医药、化工等工业领域。2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2-KGA)是D-异抗坏血酸的前体，作为一种重要的大宗发酵产品，2010年我国产量达到了40000吨左右，占世界年产量的一半以上。2-KGA工业化生产培养基采用的是蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等有机氮源，价格昂贵，成分复杂，且难以透彻灭菌，导致原料成本增加，扩大分离纯化难度而且容易引发噬菌体污染。
技术性能指标
  本研究筛选获得一株以(NH4)2SO4为唯一氮源的高产2-KGA 菌株，能有效地降低生产成本、分离纯化难度以及噬菌体污染的风险。主要技术指标：在30 L发酵罐发酵42 h，2-KGA产量达到241.6 g/L，葡萄糖得率0.93 g/g。
微生物转化生产α-酮戊二酸的关键技术
产品概况
  α-KG广泛应用于制药学、精细化工和动物饲料等工业领域。传统发酵过程中丙酮酸、富马酸、苹果酸等副产物过多，且发酵周期长。2012年我国L-谷氨酸产量为260万吨，价格约2万元/吨，是α-KG价格的1/12。因此根据谷氨酸与α-KG结构特点，寻找可以将谷氨酸中的氨基转变为酮基的重要酶制剂，从而将谷氨酸转化为α-KG，提高谷氨酸的附加值。
技术性能指标
结合文献调研和数据库检索，选择链霉菌生产的L-谷氨酸氧化酶 (LGOX)作为转化 L-谷氨酸生产α-KG 的酶制剂, 为了克服链霉菌属发酵生产LGOX周期长、酶活性低的缺点，将链霉菌LGOX的SSFG_06931基因与表达载体pET28a连接构建重组载体，转入E.coli(BL21) 中，成功构建了一株可以胞内生产高活性LGOX的工程菌株FMME089。主要技术指标：7 L发酵罐中，添加110 g/L谷氨酸，转化24 h，α-KG产量为104.7 g/L，转化率95.1%。
微生物转化生产L-鸟氨酸的关键技术
产品概况
L-鸟氨酸在食品、医药和精细化工领域具有广泛的应用。目前国际市场对L-鸟氨酸总需求量约为2000吨，而主要生产厂家只有味之素、田道制药和协和发酵三家企业，产量供不应求。目前医药级L-鸟氨酸市场价格约为35-40万元/吨。国内外主要生产方法为发酵法，该法生产周期长达72 h，产物分离困难，产量仅40-50 g/L。酶法转化精氨酸生产鸟氨酸具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、收率高、提取方便等优点，因而受到越来越多的关注。
技术性能指标
结合数据库检索和文献调研对精氨酸酶相关参数进行挖掘，构建生产水解精氨酸眯基生产L-鸟氨酸的酶制剂。通过密码子优化以及分子生物学手段，将精氨酸酶基因(ARG)过量表达于E. coli BL21(DE3)中，获得一株ARG高产菌株FMME096。FMME096经过培养基和诱导条件优化，在最优培养基中培养6 h后，ARG酶活可达177.3 U/mL；在4 h的催化周期内，L-鸟氨酸产量为112.3 g/L，对精氨酸摩尔转化率为87 %。
酶法转化生产维生素C磷酸酯钠的关键技术
产品概况
维生素C磷酸酯钠(SAP)作为维生素C（AsA）多种衍生物中性能最佳的一种，克服了AsA存在的受热、见光易分解和易氧化等缺陷，在体内磷酸酶作用下迅速转化成AsA。SAP由于其优越的性能被广泛应用于医药、化妆品、食品添加剂、保鲜剂、饲料添加剂等诸多领域。目前，工业化生产SAP主要途径为化学合成法，此法反应步聚复杂，条件不易控制，副产物较多，成本也很高。
技术性能指标
本技术方法通过基因工程手段获得了高产维生素C磷酸化酶突变菌株，经培养后，在反应体系中添加70 g/L的维生素C和0.5 mol/L的焦磷酸钠，转化8 h维生素C磷酸酯可达到44.4 g/L，转化率为45%。目前该项目正在酶工程改造，以提高底物的转化率。
酶催化合成医药中间体关键技术
产品概况
他汀类药物(Statins)是一类羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶选择性抑制剂，能够降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，是防治冠心病、脑中风、高血脂、动脉粥样硬化的首选用药。作为“重磅炸弹”药，其中仅阿托伐他汀一支药年销售即超100亿美元。目前，工业化生产他汀类药物侧链关键中间体主要途径为化学合成法，此法反应步聚复杂，条件不易控制，所需手性试剂价格昂贵，污染严重，收率低。而酶法催化生产他汀类药物侧链关键中间体具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、收率高、提取方便等优点，受到广泛的关注。
技术性能指标
本技术采用酶法合成瑞舒伐他汀钙侧链关键中间体，体现降耗环保的时代需求；采用非水相体系进行酶催化反应，解决了底物难溶的瓶颈问题。构建可实现辅酶再生的双酶基因共表达重组菌株，对底物进行不对称还原，以实现手性催化。在24 h的生产周期内，他汀类药物侧链关键中间体产量为112.4 g/L，生产强度为4.68 g/(L•h)。
微生物转化生产L-瓜氨酸的关键技术
产品概况
目前瓜氨酸在抗氧化，医用检测，保健食品，化妆品和食品添加剂等方面有着广泛的应用前景，国内外需求巨大，市场前景广阔。医药级L-瓜氨酸市场价格约为15-20万元/吨。酶法转化精氨酸生产瓜氨酸具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、收率高、提取方便等优点。
技术性能指标
在构建精氨酸脱亚胺酶(ADI)高产菌株时，以易错PCR对ADI进行突变，通过从突变文库里筛选获得一株性质改善的ADI生产菌株FMME106。通过对发酵培养条件和催化条件优化，15 g/L的菌体细胞和190 g/L的L-精氨酸在50oC、pH7.2的条件下转化8 h，L-瓜氨酸的产量为176.9 g/L，转化率为92.3%，生产强度为22.1 g/(L•h)，单位菌体L-瓜氨酸产量为11.8 g/g。

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