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youqing1025

银虫 (小有名气)

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[交流] 微生物分离

我想从土壤中分离一些细菌，放线菌，霉菌以及酵母菌
由于我是新手我们实验室在这一方面又比较欠缺，所以感觉无从下手
期待各位虫子能给介绍一下各种类型的菌分别应该选用哪种培养基以及操作步骤（包括操作中应当注意的问题）
帮忙推荐这方面的数或论文文献也可，甚至是实验中的一些心得也行
三言两语或宏篇大论都可以
很是着急，谢谢大家了

[ Last edited by youqing1025 on 2008-9-16 at 20:24 ]

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1楼 2008-09-16 20:13:26

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gudaobo

银虫 (小有名气)

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专业: 天然有机化学

我也正在做这个
这是我给老大的试验方案
不知道对你有没有用
我们是海泥，所以要加盐，你的不要加盐
海泥样品的处理

1、细菌
文献中具有代表性的方法有：
（1）取10 g盐泥加50 mL无菌生理盐水，用3O℃ ，130 r／min的摇床培养30 min，过滤取上清，得到的上清液用筛选培养基筛选，用3O℃ ，130 r／min，摇床培养48 h，涂平板，3O℃ ，培养2～3 d后，挑选培养基上生长出的单菌落，再涂平板分离纯化，直至在显微镜下镜检菌体形态一致。一株耐盐菌DL41诱导合成Ectoine及海藻糖的研究
赵艳平，郎亚军，张苓花
(1．大连工业大学生物与食品工程学院，辽宁大连 116034；
2．大连海事大学环境科学与工程学院，辽宁大连 116024)
（2）将采集的土壤样品加入生理盐水，3O℃下振荡30 min，300r／min离心，取上清液；将上清液接入培养基，3O℃下培养48 h后，分别接入含有不同浓度NaC1的培养基中，继续培养48 h；将培养液
涂布在相应NaC1浓度的固体平板上，3O℃ 培养，将长出的单菌落重复分离，直至获取纯菌。

再根据对嗜盐菌的定义：：(1)极端嗜盐菌(extreme halophiles)，其最适生长盐度为15~30 (W／V)NaC1；(2)中度嗜盐菌(moderate halophiles)，最适生长盐度为5～2O (W／V)NaCI(3)海洋细菌(marine bacteria)，能够生长在与海水盐度相当的培养基中；(4)
非嗜盐菌(nonhalopholies)，它们在盐度低的培养基中生活更好。

拟采取的分离方法是：
（1）培养基：LB营养琼脂培养基（基本）
分别添加0、3.5%、5%、10%、15%、20% (W／V) )NaCI作为筛选的培养基。
  （2）方法：取10 g盐泥加50 mL无菌生理盐水，用3O℃ ，130 r／min的摇床培养30 min，300r／min离心，取上清液；得到的上清液用筛选培养基筛选，用3O℃ ，130 r／min，摇床培养48 h，涂平板，3O℃ ，培养2～3 d后，挑选培养基上生长出的单菌落，涂布在相应NaC1浓度的固体平板上，3O℃ 培养，将长出的单菌落重复分离，直至获取纯菌。
2、放线菌
  （1）培养基
   高氏一号培养基：可溶性淀粉 20g ，KNO3 1g，NaCl 0.5g ，K2HPO4 0.5g，MgSO4•7H20 0.5g，FeSO4 •7H20 0.01g，50%海水定容1000ml, 琼脂 18g，pH 7.2～7.4）加入75µg/ml K2Cr2O7作为抑菌剂。
（2）方法：将泥样用无菌人工海水稀释到10%，40℃, 振荡 20min;取泥液均匀地涂布在高氏一号培养基上，待菌落长出以后，挑取菌落在相应的培养基上划线纯化。（这是我师妹他们采用的方法，据说是试过很多种方法以后，觉得比较好的，但是菌落较密）

拟采用的方法：
（1）培养基：基本高斯一号培养基，分别用50%和100%的人工海水配制。
（2）方法：
将泥样用无菌人工海水稀释到2.5%、5%、10%，40℃, 振荡 20min;取泥液均匀地涂布在两种高氏一号培养基上，待菌落长出以后，挑取菌落在相应的培养基上划线纯化。

3、真菌
文献报道土壤中真菌分离的较少。
结合放线菌分离的方法，拟采用的方法是：
（1）培养基：普通PDA培养基，分别用无菌水、50%和100%的人工海水配制。
（2）方法：将泥样用无菌人工海水稀释到2.5%、5%、10%，40℃, 振荡 20min;取泥液均匀地涂布在三种不同浓度人工海水配制的PDA培养基上，待菌落长出以后，挑取菌落在相应的培养基上划线纯化。