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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 融合蛋白表达时会不会只有标签表达，我的质粒构建木有问题，
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yuanxiaoxin

新虫 (初入文坛)

[求助] 融合蛋白表达时会不会只有标签表达，我的质粒构建木有问题， 已有3人参与

融合蛋白表达会不会只有标签表达，我的质粒构建木有问题，测过序，且目的片段与标签之间木有终止密码子，但是过完镍柱纯化后只有标签表达了，各位大神，可否遇到过这种问题啊。。
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1楼 2015-11-21 10:51:50
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白不表达。
2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，可能需要真核表达系统，或者要先切内含子才能表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
2楼2015-11-23 10:16:42
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绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
镍柱说明是用的組氨酸标签了，一共2kDa，你怎么判断只有标签……信息不够吧，是不是带了其他标签，有时候蛋白太大了，在大肠杆菌里是不表达或者表达量极低的

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3楼2015-11-23 11:15:38
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yuanxiaoxin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-11-23 11:15:38
镍柱说明是用的組氨酸标签了，一共2kDa，你怎么判断只有标签……信息不够吧，是不是带了其他标签，有时候蛋白太大了，在大肠杆菌里是不表达或者表达量极低的

是的，带了其他的标签，27KDa
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4楼2015-11-23 12:33:24
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是如何判断表达不表达的啊，诱导前后SDS-PAGE比较，序列没问题，标签表达了，目的应该也会表达。祝顺利哦
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5楼2015-11-23 13:32:51
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yuanxiaoxin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-11-23 10:16:42
1.二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白不表达。
2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基 ...

标签是在目的基因的前面啊可是，不该顺着劲儿就表达下来了么
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6楼2015-11-23 16:53:51
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绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by yuanxiaoxin at 2015-11-23 12:33:24
是的，带了其他的标签，27KDa...

有时候会提前终止的，建议你换个载体，试试GST或者sumo 或者mbp标签……或者换个表达体系，试试昆虫或者哺乳细胞……

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7楼2015-11-24 01:06:09
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MarchZR

银虫 (小有名气)
过完镍柱纯化只有标签蛋白不是很好嘛，没有杂蛋白
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8楼2015-11-26 11:42:28
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2015-11-28 23:39:32
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小小细胞啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by MarchZR at 2015-11-26 11:42:28
过完镍柱纯化只有标签蛋白不是很好嘛，没有杂蛋白

她的意思是只有tag没有目的蛋白

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10楼2015-11-28 23:43:37
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