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bobe5605

银虫 (小有名气)

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[求助] Fe3O4磁珠为什么修饰不上COOH呢？

最近做Fe3O4磁珠，主要目的应用连接蛋白或抗体以分离细胞
按（J. Gao, X. Ran, C. Shi, H. Cheng, T.Cheng and Y. Su, Nanoscale, 2013, DOI: 10.1039/C3NR00931A.）水热法合成了磁珠并TEOS包硅。
该文章重复性不错，得到的磁珠经TEM分析分散性，均一性都很好，稍微有点欠缺就是磁珠稳定性不是非常好，如果不包硅，2-3天在水溶液就变黄（氧化了）。这点也问过文章作者，确实如此，包硅了就好多了。
下一步，我是要把磁珠修饰成 COOH 磁珠，主要原理是磁珠-TEOS硅化- APTES NH2化- 丁二酸酐 COOH化，按图示原理进行。磁珠-TEOS硅化按以上文献，TEM测试无问题，主要是APTES NH2化- 丁二酸酐 COOH化出现问题。我也不知道究竟出了什么问题，因为条件所限，无法去表征，只好接着做应用和蛋白交联。结果发现，做好的COOH磁珠和蛋白不发生交联。

百思不得其解，不知道以下步骤哪里出了问题。哪位熟悉的帮我看一下，究竟出了什么问题COOH反应步骤：
（1） APTES 氨基化取1/3硅化磁珠,约30mg) 溶解在25ml乙醇中，加1ml APTES，常温搅拌反应16 hr，反应后用乙醇洗3遍磁分离。
（2） COOH化取以上1/2反应液，加10ml 乙醇，与800mg 溶解在DMSO（5ml）中的丁二酸酐混合反应16小时，过量的DMSO用乙醇洗5次，磁力或离心分离，最后用4 ml乙醇溶解。

COOH磁珠与蛋白BSA的交联:
取以上磁珠1ml （浓度大约1mg/ml ），用buffer(0.1M MES, 0.15 M NaCl, pH4.9 ）磁分离洗2-3次；最后加0.67ml buffer，0.18ml EDC(10mg/ml),0.15ml NHS(10mg/ml) 常温反应2小时（做对照，对照不活化，加buffer替代），之后磁分离去除EDC/NHS；加0.06ml 0.5g/l BSA，常温颠倒反应24小时。反应完后，磁分离上清，用BCA测蛋白浓度。

结果发现：BSA基本只减少了10%左右，和对照（不加EDC/NHS活化）的蛋白浓度一样，也就是说交联上COOH磁珠的只有10%左右（或者说是非特异性吸附）。

哪位熟悉这个领域的请帮我看看，十分感谢，十万火急。

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