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我爱吃水果金虫 (正式写手)
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谁知道TB buffer啊？
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在制感受态的操作中见到了TB缓冲液 这个东东是可以单独购买吗？价格多少？ 在网上看到了配方，那个 PIPES 要怎么买啊？ |
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金虫 (正式写手)
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3楼2008-09-12 16:34:50
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参考： http://www.zjubiolab.zju.edu.cn/NewsContent.aspx?ID=218 制备高效率感受态的方法 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌 E.coli DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3mm 的单菌落*可多个, 接种到250ml/3L锥形瓶或80ml/1L 锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度 150-250RPM 培养19-50h *没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10min 4度, 300RPM离心15min, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10min再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟0.1-1ml 分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存. TB溶液*TRANSFORMATION BUFFER： PIPES 3.0G 10mM CaCl2.2H2O 2.2g 15mM KCl 18.6g 250mM add water up to 950ml 用 5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶 再加终浓度为55mM的MnCl2.4H2O 10.9g 定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存. 但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒. 【zihudie】 （1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。 （2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。 （3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 （4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 （5）重复第4步操作。 （6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。 （7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。 本法效率极高,建议大家采纳 【yog】 1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5) 2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml 0.1MCaCl2中, 冰浴20min 3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min 建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。 以下为转贴，具体方法请最好查阅文献。 E.coli感受态细胞制备方法: 单菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600=0.2-0.4 离心后用10ml TSS重悬后,分装 -70度保存。尽量冰上操作. 转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42度 90秒，冰上2min，加LB至1ml , 37度 1小时后铺抗生素平板。 TSS: 7.0ml pH6.1 LB 2.0ml 50% PEG6000 0.5ML dmso 0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 0.3ml ddH2O [ Last edited by 香菱儿 on 2008-9-14 at 08:36 ] |
6楼2008-09-14 08:34:23