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柳弯儿

新虫 (正式写手)

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[求助] 做RFLP-PCR，PCR阶段P不出条带,急急急！求助大神！已有1人参与

各位前辈大家好，我最近在做RFLP-PCR，实验出了点问题，由于专业不是分生的，所以请教一下各位前辈。
血液基因组提取DNA，PCR，内切酶酶切，这是我的大概过程。
今天刚开始做一个新位点，PCR未p出条带。
分析：1、DNA模板应该没有问题，之前已经顺利做完一个基因位点；
2、引物是按要求溶解稀释的
3、PCR退火温度是58℃，大概过程是94-5min，35循环（94-35s，58-30s，72-20s），72-5min。
4、有同学说可能是扩增片段里GC含量高所致。
跪求各位前辈指点一下，可能是什么原因，该怎么改进实验条件。万分感谢！

附上我的序列和引物，（A）为突变碱基位置，前辈们帮忙看看，问题到底出在哪？谢谢了。
序列：GATTAGCCTGGGCAACATAGGGAAACCCCGTCTTTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAAGAAAAAGGAAAGAAAAACACAAAAAGTGCTGGGATCACAGGTGTGAGCCACTGCGCTCAGCCCCTTTCTGTTTCTTTTTGTGATCCTCCCAACCCTCTTCTCCCTCTGAATCTGTCTCTGGGACTGTCTCTGTCTCCCCGTCTTCCCTCCCTTCCTCACCCTGTCTATCTCTCTCTGTATGTCTCTTGGTGTGTGTGTCTCTCTCGATGTTTTTCTCTCTGCCTGTCTGCCTGTCTGTACCCCTCTGCGTCTCTCCCCGCCCCCATCCGTCTGTGTCGCACGCGCACCCCCATCGGGCTTCTGCTCTTGTCAATTGCCCCTGGGGCCCTGCCCCCACCTCCGCCCCAGTTTCCTTCTACAAGCCTCAGTCTCCAGCTTTGAAAACTGGGCAGGCGTCCCCCCATCCGCACCCCCACCCCTTCCCCACGCATTCCCCGCTCGGTC（A）CGGCTGTCCACCGGCCAAGCTCAGGCGCGTCCTGGCCCAGGGCCGGGCGGAAGGGAACCAGTCCAGGGCCAGCCAGGCTGCGCCGGGGGCGCGCGTCCGGGAAGCGCCCCTCCTGCCCCGCCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGCCCCGTGCTTGCAGTTTCCTATAAGTAGCCGGCTCTCGGTGCCAGCCTCAGCCTGACTTCAGCGCTCCCACTCTCGGCCGACACCCCTCATGGCCAACCGTTACACCATGGATCTGACTGCCATCTACGAGGTGAGTCCCCGCCGCACGGCATCCCCGGTACCTGCATGCCTGAGTCCGAGTCCCCACCTCTCTAGCGCCGCAAACTCCAGCCCGGGACGCTTGCCTCCCTTCTCCAACTGGGGCTCCCTAGCGCCGCGCCCTCCAGCCTGGGGCCCCTGCCTCCCGCTCAGACCAGCTTGGT

引物：F:TCGGGCTTCTGCTCTTGTCAAT
R：GCACCGAGAGCCGGCTACTTAT