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xtmgah31银虫 (小有名气)
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[交流]
降落PCR
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降落pcr结束后，用PCR产物在进行几个循环的扩增是做什么用的呢？ 94 ℃预变性 5min ; 第1、 2 循环 94 ℃变性 1 min ,64℃退火 1 min , 72 ℃延伸 2 min ; 其后的 18 个循环 ,退火温度每 2个循环降低 1 ℃,其他条件不变; 最后 15 个循环退火温度为55 ℃,其他条件不变; 72℃延伸 10 min。 PCR产物经过一次扩增 (95 ℃0.5 min , 50℃0.5 min , 72℃1 min ,循环 3 次; 72 ℃延伸 10 min) 后 ,用 PCR产物纯化试剂盒(申能博彩)纯化 |
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sxdxrhyy(金币+2,VIP+0):鼓励！欢迎常来！
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其实是很简单的，所谓降落PCR就是逐步降低退火温度，从而寻找一个最合适的退火温度，简单的说吧，在做PCR的时候只有在合适的退火温度下，引物与模板才能够有效地配对，此时的扩增是以指数的形式增长，当不能很好的配对的时候就是倍数的形式增长。是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown” 退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出 现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正 确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两 倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的 产物可以得到富集。该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。 具体过程如下：使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物， 这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各 长18个碱基（6个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。 使用简并引物即可以进行“TouchdownPCR”。 我曾经试过，效果还是很好的！可能写的不清楚，你们刻以看看相关的文献 |
4楼2008-09-13 02:50:15