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devil2006木虫 (正式写手)
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[交流]
求助：酶切片段分子量大小问题
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| 我想问一下，我做PCR产物酶切反应，如何才能确定酶切片段的分子量大小，我查的文献说酶切片段大小是320+230+180+150，请问如何才能确定的如此精确，只用marker就可以确定吗？还是有什么电泳图的分析软件？需要测序吗？ |
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4楼2008-09-06 17:11:27
2楼2008-09-06 09:10:35
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devil2006(金币+1,VIP+0):首先，非常感谢你的回答o(∩_∩)o... 我用的是3%的胶，电压80V，电泳时间大约为1h，从电泳图上看酶切片段都差不多在应该的位置，只是不能确定例如片段大小到底是320还是330，只能大约的估计吗？
devil2006(金币+9,VIP+0):刚才金币给少了，不好意思啊
devil2006(金币+1,VIP+0):首先，非常感谢你的回答o(∩_∩)o... 我用的是3%的胶，电压80V，电泳时间大约为1h，从电泳图上看酶切片段都差不多在应该的位置，只是不能确定例如片段大小到底是320还是330，只能大约的估计吗？
devil2006(金币+9,VIP+0):刚才金币给少了，不好意思啊
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聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分开，如果楼主嫌麻烦，琼脂糖凝胶电泳理论上也是可以分开的。用50bp的marker大致可以确定。 跑电泳时，凝胶浓度要大，大约1.5%~2%，低电压长时间跑。不过也不宜太长时间，片段会扩散。染色时间稍微加长。320和150的差距还是很大的。 另外，楼主也可以分析一下，这四个片段之间的关系，比如说，如果有320bp的片段则一定有180bp（或者其它任何一个bp）大小的片段，这个时候就不用非要看电泳结果了。琼脂糖凝胶电泳的精确度还是低了一些。 测序的话，应该需要连接到一个已知载体上，测序周期比较长，大约一周左右，而且费用较高，如果楼主这一步的试验不是关键试验的话，就先假设酶切正确，继续下面的试验。 祝好运。 |
3楼2008-09-06 16:03:49
longxiange520
金虫 (小有名气)
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devil2006(金币+5,VIP+0):你的回答对我很有用，谢谢
devil2006(金币+5,VIP+0):你的回答对我很有用，谢谢
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跑琼脂糖凝胶电泳一般只能通过marker了解到大致的片段大小，不过我发现你的这些片段大学可以用20bp DNA ladder Marker,因为20bp DNA ladder Marker如果跑的教好的话有20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、300bp、400bp、500bp，这样的话你可以根据条带的相对位置来确定了。不过像上面虫友说的50bp的marker也是可以的哈！ 当然这个要求Agarose浓度较大，要4%-8%，所以最好使用低熔点的Agarose，只是要贵一点哈。 [ Last edited by longxiange520 on 2008-9-7 at 08:56 ] |
5楼2008-09-07 08:39:59