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沨1101金虫 (小有名气)
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[求助]
刚刚接触RNA干扰，但是不知道这个RNA序列怎么来，用什么软件来做，怎么选择等等问题。已有3人参与
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刚刚接触RNA干扰，看了一点文献，但是文献中并没有提到这个RNA怎么来的？难道这个RNA要自己设计吗？ 请问一下用什么软件设计，又有什么要求之类的？ 急呀，求大神帮忙！ |
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1998年，Fire等人发现正义RNA或反义RAN技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录所得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异阻断相应基因的表达。他们称这种现象为RNA干涉（RNA interference, RNAi)。 RNAi的作用机理为：  外源的或体内产生的长双链RNA(long double stranded RNA,dsRNA)首先被Dicer酶降解为长21-23bp长度的小分子双链RNA（称为小干扰核酸，small interfering RNA,siRNA),这是一个依赖ATP的耗能过程。siRNA作为RNAi的中介分子，是一种具有3'两个核苷酸TT突出末端的21～23bp大小的双链核糖核酸，通过序列互补配对法则特异性降解目的基因。 然后，siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体（RISC，RNA-induced silencing complex）。该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC。活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理定位到具有同源序列的基因转录体，并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA, 最终导致基因沉默效应。 同时，RNAi过程中又有新的dsRNA分子合成,当siRNA反义链识别并结合靶mRNA后,siRNA反义链可作为引物,以靶mRNA为模板，在依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割产生新的siRNA,新siRNA再去识别新一组mRNA,又产生新的siRNA,经过若干次合成切割循环,沉默信号就会不断放大。正是这种称为靶序列指导的扩增(target-directed amplification)机制赋予了RNAi的高效性和持久性。 由于RNAi能高校特异地阻断基因的表达，有研究已构建能形成发夹结构RNA（hairpin RNA,hpRNA）的载体，用此载体装载目的基因的正向片段和反向片段，通过农杆菌转化植物，使其转录和加工出siRNA，引发相应的mRNA降解，为研究基因功能提供有效工具。  因此，dsRNA是RNAi载体上转录的pre-RNA，由于正向片段与反向片段互补所形成的发夹结构RNA。由于RNAi载体是环状双链DNA，一般目的基因的正向片段和反向片段的序列相同，只是插入载体的方向相反。 由于dsRNA被剪切产生的micRNA是依据碱基互补配对原则靶定mRNA，一般在目的基因的CDS上设计引物扩增98bp-853bp正向片段和反向片段，既可以是ORF，也可以是UTR。用cDNA做PCR模板，记得片段两端加上酶切位点。  参考资料： 1. 植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用 2. 苹果多酚氧化酶双链RNA干扰_dsRNAi_研究 3. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants 4. RNAi的作用机理与应用 |
2楼2015-10-13 19:30:19
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1. 你们实验室有RNAi载体骨架，也就是可以直接插入目的基因正向片段和反向片段的重组质粒吗？我们需要依据RNAi载体骨架的酶切位点设计引物。比如，2楼的pHANNIBAL载体骨架，其正向片段插入位点为XhoI和KpnI，反向片段插入位点为ClaI和XbaI，这些位点序列需要加在相应引物的5‘端。 2. 你们RNAi实验针对的目的基因是什么？这个目的基因的cDNA需要是已知的，只有部分cDNA序列也可以。我们就根据cDNA序列设计引物，扩增带有相应酶切位点的正向片段和反向片段。比如，2楼文献《苹果多酚氧化酶双链RNA干扰_dsRNAi_研究》中的目的基因——苹果多酚氧化酶（apple polyphenol oxidase, APPO）基因。其cDNA序列可以从NCBI Genbank中搜索“apple polyphenol oxidase”查找http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/D87670.1 。 3. 首先，根据cDNA设计普通PCR引物，可以使用在线Primer3 http://primer3.ut.ee/。PCR产物可以98bp-853bp，但为了便于酶切和连接操作，我们以一般选择500bp以上的。然后在引物的5'端加上相应的酶切位点和保护碱基即可。比如，2楼文献《苹果多酚氧化酶双链RNA干扰_dsRNAi_研究》中扩增710bp的引物。当然，这710bp片段不是唯一的，可以是该cDNA上容易扩增的任意片段。 设计要求不高，只要能扩增出来即可。但即可酶切位点要相对应，确保插入载体的正向片段和反向片段的方向相反。 |
4楼2015-10-14 20:10:44
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What can I do for you? BTW, how about your negative control without insert DNA, which can be used for confirming double digestion completely? Maybe you can make the vector ends blunt. Then a single T will be added respectively to the 5′ ends of the vector with Taq DNA polymerase. After that a TA-cloning-like assay will be done, and the direction of inserted DNA can be selected by sequencing. 发自小木虫IOS客户端 |
12楼2016-03-01 22:50:31