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[交流]
眼下在做关于青枯病的课题 出了问题难以解决 已有3人参与
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本人是大四 本科生 现在在毕业实习阶段 老师的课题是关于云南省烟草青枯病和黑胫病的，我被分到了烟草青枯病这一块 涉及到分子研究 之前是另外一个实验室分出来的菌落 引物是自己设计的 根据的是genbank上的GMI1000（许多文献上用的都是这个基因组的序列）然后老板告诉我 细菌dna 直接 在菌落上沾一点在体系里面就能跑出来了 然后我就试了一下 结果没跑出条带来 后来自己又用试剂盒提取了一次dna 然后确认了里面确实有dna了 再跑了一次 又没有跑出来 没办法就找了文献中有的引物 合成了几对 每个都试了一次 但是结果出奇的一致：没有跑出要得条带反而在的大概在 2000bp和点样孔中间跑出了一条微微的条带 当然没有什么卵用 我在想是不是菌出问题了 于是自己分菌 和之前做过青枯菌分菌的人交流了一下 ：在TZC上划线涂版 会出现两种菌落一种是大的无规则的圆形 中间粉红 边缘白色 另一种是小的圆形 完全的玫瑰红色 这应该是因为菌落的致病性差异所致 后期小菌落周围会变黄可能是菌株不纯 TZC培养基：10G 蛋白胨 10g 葡萄糖 1g水解络蛋白 18g琼脂 0.05gttc加入5ml无菌水另外高温杀菌 冷却后加入 同研究组的另一位老师也亲自分了菌给我 加上我自己分出来到的菌 又用特异性引物跑了一次 结果还是没跑出来 。。。。。 老板说：你作个16s吧 没办法 我就只能用通用引物27f/1492r 序列如下 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT 跑16s 然后跑出了1500bp的条带这就说明 dna 也没问题试剂没问题 图片传不上去 但是确实在1500那里有明亮条带 然后把PCR原液拿去一代测序 双向测序 测序公司告诉我 1492r那里有双峰 27f正常 每个样品得到了两个序列 然后blast duang！！！！结果是大肠杆菌 ？？ 老板说你这菌污染了吧 我想想有这个可能 于是再次纯化 挑单菌落直接pcr 前后送了十几个样品 多次测序 还直接把菌液给试剂公司的人 提取dna 然后结果出奇的一致 我开始怀疑人生了 然后又听说云南省的青枯菌 可能不是 劳尔氏菌引起的 而且另一边实验室用这个菌去接种烟草也一直没有接上 同校的以前做青枯菌的许多都不做了 说是接种难 保存难 我觉得自己还是pcr那一块出了问题 于是就按照文献的引物 文献的体系 pcr各个温度 扩增次数 一点没变 设置梯度Mg+浓度 稀释dna浓度 梯度 也用过mix 体系然后 呵呵 。。。 之前黑胫病的pcr也是我跑的 跑出了特定条带 所以我觉得pcr技术这一块我没有问题 现在换了一家公司进行引物合成 换 759/760那一对 测序也拿到北京去测序 自己一方面要考研 一方面试验只有自己一个人做 有点寝食难安 心力交瘁 希望能在这里得到做过烟草青枯病 分离培养 或者分子方面各位老师的一些指点 在此表示感谢 |
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cugmxl
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