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摘要：微小RNA基因和小的干涉RNA是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。它们功能的重要性提示我们基因组非蛋白编码区的序列蕴含着极为重要的信息。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。 关键词：小RNA，siRNA，miRNA，非蛋白编码区 引言 长度大小为二十几个核苷酸的小片段RNA在近年得到了极大的关注，这些小RNA中有些可直接调控某些基因表达，进而调控细胞发育、决定细胞分化，有些介导特异性反应。2003年5月，Steven Buckingham提出的被广泛认同的分类方法中，小RNA（small RNAs）是指非编码RNA中除转录RNA（包含核糖体RNA和转移RNA）外的部分，包括微小RNA（Micro RNAs）、小的干涉RNA（short interference RNAs ，siRNA）、核仁小分子RNA和核小RNA（snRNA）。基于最新的科研成果，本文对小RNA尤其是siRNA和miRNA的特点、功能、生成过程以及筛选识别等进行综述。 1. 小RNA的概况及特点 1.1 siRNA RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。1999年, Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21～25nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后,Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi 中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。siRNA 的3´-末端2-nt 的突出对靶点识别的特异性起一定的作用,可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。最近的《nature》周刊报道了两个研究小组以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展，科学进展已清晰地表明：在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs,shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉寂已经成为强大而有力的生物工具。 1.2 miRNA miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4,2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长度为22nt左右的5´端带磷酸基团、3´端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。 植物miRNA从2002年起才有报道，编码植物miRNAs的基因明显不同于其他生物，这样，植物编码miRNA基因的转录产物可能更大，植物的miRNA与互补结构的错配一般也少于动物，所以在进化上也更为保守。但和动物miRNA一样，miRNA的转录产物也是发夹状结构，在RNaseⅢ酶切后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。 miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20-24nt，但在拟南芥和烟草中发现26nt的RNA，四膜虫(Tetrahymenas)中发现28nt的miRNA。成熟的miRNA 5´端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。 许多miRNA的基因结构及功能在进化中有保守性，约12%的miRNA在线虫、果蝇、植物及哺乳动物中保守且保守片段的差异仅为1-2nt。在线虫C.elegan中所发现的miRNA85%都可以在C.briggsar的基因组中找到同源序列。细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中去无任何表达的迹象；又如20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12,却找不到miR3-miR6,在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。 1.3其他小RNA 在生物体中，存在一类不同于miRNA和siRNA的小RNA，长度在20-28nt之间。这类RNA的结构、生成、功能未知。推测可能来源于dsRNA两极，是不同RNaseⅢ酶的产物。 2.小RNA的生成及作用机制 2.1siRNA的生成及作用机制 siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在 Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。 RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。 siRNA识别靶序列是有高度特异性的，但这并不是说反义链上所有的碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应，相对而言，3´末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。 2.2 miRNA的形成及作用机制 迄今的研究认为，miRNA可能的形成及作用机制为：先由长的内源性转录本（pri-miRNA）生成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA），然后在Dicer酶的作用下使其加工成为一个不稳定的dsRNA分子，接着迅速被降解剪切为22nt左右的单链RNA（这种单链RNA及以后的miRNA只是Dicer作用下pre-miRNA被剪切的一个臂，可能是3´端的一个臂，也可能是5´端的一个臂，不同RNA可能是同一pre-miRNA的不同臂），之后被PPD(PAZ&Piwi domain)蛋白家族识别，形成RNA-蛋白质复合体即miRNA核蛋白体（miRNP）,进而形成成熟的miRNA。miRNA识别并与靶标基因3´UTR区部分配对，从而抑制靶标基因的翻译。 miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA,这说明某些miRNA和siRNA一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3´端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。 科学家们已发现miRNA在动植物早期发育中起的关键调节作用，包括植物叶、花的发生，动物胚胎及组织发育等，Brennecke等人利用电脑寻找靶标基因，证实了miRNA不完全结合 3´UTR中存在细胞死亡诱导基因，这提示说明miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。同时，科学家们也发现人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。 3. siRNA与miRNA的关系 siRNA和miRNA在功能和作用机制上有很大的相似性，但同时在结构等方面又有很大的区别，在进化上二者的关系也尚无结论。 3.1 miRNA与siRNA的相同点 miRNA与siRNA之间有许多相同之处，具体如下： a. 二者的长度都约在22nt左右。 b. 二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。 c. 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。 d. 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。 e. miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。 3.2 miRNA与siRNA的不同点 a. 二者的根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。 b. 在结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。 c. Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。 d. 在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3´-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。 e. 在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 f. miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。 3.3 miRNA与siRNA的进化关系 miRNA与siRNA在加工机制上的相似性使二者的界限已经越来越不明显了。二者在进化关系上是从属关系还是平行关系，它们的进化顺序是什么，这都引起了生命科学领域的广泛争论，且目前尚无定论。Hutvagner和Zamore通过试验，认为miRNA或siRNA的功能发挥取决于它与靶标基因结合位点的匹配程度，而用于识别miRNA的PPD家族的很多成员为RISC的组分，这样，二者的界限则更为模糊，它们可能并不存在本质的区别，就此意义上讲，siRNA似乎是miRNA的一个补充。在进化顺序上，我个人倾向于miRNA先于siRNA，尽管有些人认为外源基因应早于生物进化出现，但是siRNA是一种干涉RNA的中介产物，它必须有病毒或是其他双链RNA诱导才能形成，且siRNA的阻遏方式过于彻底，应该是生命发展到一定程度后才产生的。 4.小RNA的识别、数据库建设及最新进展 在真核生物小RNA基因的计算机识别上，麻省理工学院的Lim小组开发小RNA基因预测程序MiRscan评分系统，进而对人类和线虫的基因进行探索，确定小RNA分属的家族及保守性质。 《nature》周刊近期报道了在RNA干涉过程中利用PAZ域对siRNA进行识别，方法是将siRNA的三个悬臂固定。但是PAZ可能不是在RNA干涉中的唯一识别方式。 Patrick.J.Paddison等人的两个研究小组报告了以数以千计的人类和老鼠为目标的RNAi库的创建，在哺乳动物中对小RNA的研究将使其有有长足进步。 5月出版的Science报道了由EB病毒编码的微RNAi，这是一项全新的发现。因为大家知道RNAi技术的前提是双链的短RNA，而病毒则是单链的DNA/RNA。这一研究成果将为RNAi应用提供了更广阔的前景。 在基因操作较困难的神经元中，已有成功进行RNAi的报道。Krichevsky等将化学合成的21nt siRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。抑制神经元NO合成酶表达能有效降低疼痛，在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表达，获得RNA干扰的成功。RNAi能在极低浓度（nmol范围）siRNA存在下显示出特殊有效性。 广东省科技攻关项目“防治SARS疾病特效siRNA药物研究”课题组2003年6月开始针对SARS冠状病毒的RNA基因组特定靶位点自行设计了共48条双链RNA小分子，通过体外细胞实验系统成功地筛选出了4条对SARS冠状病毒有效的双链RNA小分子，这些双链RNA小分子在体外培养细胞中能特异地且非常有效地阻断SARS冠状病毒的感染及病毒增殖。其预防SARS冠状病毒的效果达到90%以上,几个有效的双链RAN小分子联合使用其治疗效果达到80%以上，而且实验结果均得到重复验证。经过siRNA预防或治疗后，原来感染SARS冠状病毒的绿猴胚肾细胞多能保持正常的细胞形态和数目。 5.对小RNA基因的讨论及展望 小RNA的研究给我们带来比其本身更为重要的启示是基因组非组蛋白编码区蕴含着重要的生命功能活动信息。生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些非蛋白编码小RNA的调控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我们更是知之甚少。长期以来，分子生物学研究的重点都在蛋白编码基因上，而小RNA的发现和研究则提示我们应该相对更多地从这方面了解生命的奥秘，这些小RNA可能编码生命活动的重要调控元件。有报道称小RNA可影响四膜虫的细胞分裂，如果该种小RNA在人类中存在，则可能与癌症有关，2004年6月《临床研究杂志》上发表的一项实验室研究， siRNA似乎加强了伊马替尼（Imatinib）和雷帕霉素的抗癌作用。而且据说，这种治疗在出现药物耐受性时特别有帮助。SiRNA可以通过与HIV-1细胞内受体CD4，病毒结构蛋白Gag或替代Nef调节蛋白的绿色荧光蛋白的靶mRNA作用抑制病毒产生。SiRNA能有效抑制HIV-1生命周期中整合侵染前后事件。这样，siRNA可能应用到HIV-1和其他病毒侵染的治疗干预中。siRNA技术可能用于抑制HIV-1在宿主细胞中的复制的一种可能的治疗策略。利用小RNA有效抑制基因表达的机理可能为治疗很多病毒性疾病和基因疾病寻找新的途径和突破口。 小RNA还有许多问题需要我们去研究：它们的作用机理究竟是什么，具体有什么功能，它们通过什么途径识别靶标基因，它们的特异性和时序性是如何调控的等等。随着研究的深入，它将为人类疑难疾病治理等方面起更为深远的作用。总之，对小RNA基因的研究将是生命科学领域研究的热点，也将是揭示生命奥秘的又一大里程碑。 参考文献 [1]Baulcombe D.ARNA microcosm.Science,2002,297(5589):2002-2003 [2]Calin G A,Dumityu C D,Shimizu M,et al.Small RNAs:the genome′s guiding hand? Nature, 2002,420(6917):732 [3]Chang-zheng Chen et al.MicroRNAModulate Hematopoietic Lineage Differentiation，Science，2004,303(5654):85-86 [4]Daisuke Shirane,Kohtaroh sugao,et al.Enzymatic production of RNAi libraries from cDNAs,Nature genetics,2004,36:190-196 [5]Dennis C.Gene regulation:The brave new world of RNA .Nature,2002,418(6894):122-124 [6]Dianne S.Schwarz et al.Asymmetry in the Assembly of the RNA:Enzyme Complex, Cell, 2003,115(2):199-208 [7]George Sen,Tom S Wehrman,Jason W Myers&Helen M Blau.Restriction enzyme-generated siRNA(REGS) vectors and libraries,Nature genetics,2004,36:183-189 [8]Hutvagner G,McLachlan J,Pasquinelli A E,et al.A cellular function for the RNA –interferrnce enzyme dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA.Science,2001,293(5531):834-838 [9]Jeffrey M.Vargason.et al.Size selective Recognition of siRNA by an RNA sliencing Suppressor,Cell,2003,115(7):799-811 [10]Jin-Biao Ma,Keqiong Ye&Dinshaw.Patel.structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domian,Nature,2004,429:318-322 [11]Kapranov P,Cawley S E,Drenkow J,er al.Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22.Science,2002,296(5569):916-919 [12]Lee, N.S. et al. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cell. Nature Biotech. 2002，20：500-505 [13]McManus M T,Sharp P A.Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.Nature Reviews Genetics,2002,3(10):737-747 [14]McManus, M.T., Petersen, C.P., Haines, B.B., Chen, J. &Sharp, P.A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA ，2002，8：1-9 [15]Mourelatos Z,Dostie J,Paushkin S,et al.miRNPs:a novel class of riboncleoprotions containing numerous microRNAs.Genes&DEV,2002,16:720-728 [16]Patrick J.Paddisom,Jose M.Silva,Douglas S.Conklin ,et al.A rescource for large-scale RNA-interference-based screens in mammals,Nature,2004,428:427-431 [17]Reinhart B J,Bartel D P.Small RNAs correapond to centromere heterochromatic repeats. Science,2002,297(5588):1831 [18]Soraya Yekta,l-hung Shih,David P.Bartel.MicroRNA-Directed Cleavage of HOXB8 mRNA,Science,2004,304(5670):594-596 [19]Victor Ambros.MicroRNA Pathways in Files and Worms:Growth,Death,Fat,Stress,and timing,Cell,2003,113:673-676 [20]Xuemei Chen.A MicroRNA as Translational Repressor of APETALAZ in Arabidopsis Flower Development,Science,303(5660):2022-2025 [21]蔡子微等.NS特异性siRNA真核表达载体的构建.牡丹江医学院学报.2003，24（3）：1-4 [22]陈颖，朱明华. RNA干扰.中国生物工程杂志.2003，23（3）：39-43 [23]杜梅君，刘德培，梁植权. RNA干扰与染色质沉默. 生物化学与生物物理进展.2004，31（3）：204-207 [24]郭晓红，周忠孝。转录后水平的基因沉默—RNA干涉.基础医学与临床.2003，23（1）：24-28 [25]李继霞，周克元.miRNA的研究进展.生物化学与生物物理进展.2003，30（5）：702-705 [26]马鹏鹏，薛杜普，韩代书. RNA干扰技术及其应用.中国组织化学及细胞化学杂志.2003， 12（2）：201-207 [27]沈维干. RNA干扰的研究方法.实用临床医药杂志.2003，7（1）：75-77 [28]汪之沫，廖玲洁. RNA干涉和基因沉寂.国外医学遗传学分册.2003，26（3）：129-132 [29]叶茂，陈跃磊，明镇寰. miRNA（MicroRNA）家族的研究进展. 生物化学与生物物理进展.2003，30（3）：370-374 [30]叶亦舟，王以政，郭爱克. RNA干扰技术及其应用.生命的化学.2002，22（6）：503-506 [31]张鹏飞.siRNA的设计、合成与转染及其在RNA干扰中的应用.国外医学临床生物化学与检验学分册.2003，24（4）：199-200 Progress in the Research of Small RNAs Abstract: Small RNA gene and little interference RNA are main components of small RNA, their correlation is close, not only have similarity, but also have difference. Their important function point out to us albumen unencoding area contains extremely important information. The deep research of small RNAs will lead us to find out the secret of life. Keywords:small RNAs,siRNA,miRNA, albumen unencoding area |
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Human RNA silences viral DNA(2005.4.26)
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MicroRNA plays an unexpected role in the process, researchers report in Science | By Charles Q Choi RNA silencing can defend against viruses in humans, French scientists report in this week's Science. Surprisingly, say the scientists, microRNA (miRNA) appears to form the basis of this system. "MiRNAs were thought to be involved in the regulation of endogenous genes, whereas exogenous RNAs, in particular viral RNAs, were thought to be regulated by siRNA [small interfering RNA]," lead author Charles-Henri Lecellier at the Institute of Plant Molecular Biology in Strasbourg, France, told The Scientist. Prior studies have revealed that RNA interference can destroy viruses in plants and insects, but a similar role in vertebrates has not been demonstrated. Since RNA silencing can suppress endogenous retroviruses from mobilizing in plants, yeast, worms, and flies, Lecellier and colleagues reasoned that retrotransposition of mammalian exogenous viruses might also prove vulnerable. They chose as their model system the primate foamy virus type 1, a retrovirus akin to HIV. PFV-1 accumulation in cultured human embryonic kidney cells was strongly enhanced by the expression of the P19 silencing suppressor, suggesting that a siRNA or miRNA pathway limited PFV-1 replication in human cells, because P19 specifically binds to and inactivates both. To identify the target and means of human RNA silencing, the investigators fused viral sequences spanning the PFV-1 genome to a green fluorescent protein (GFP)–tagged reporter gene into constructs cotransfected with PFV-1 into baby hamster kidney cells. Northern and Western analysis revealed GFP levels from construct F11 were disproportionately reduced compared to F11 mRNA accumulation, which reminded researchers of miRNA translational inhibition. The DIANA-microT algorithm revealed a high probability match between the F11 sequence and the human miR-32. Further studies demonstrated miR-32 silencing was suppressed in P19-expressing cells. Also, anti-miR-32 locked nucleic acid oligonucleotide almost doubled progeny virus production, unlike anti-miR-23, suggesting miR-32 has a direct, sequence-specific antiviral effect. In plants and insects, all viruses targeted by RNA interference encode proteins that suppress RNA silencing. Further studies found that in PFV-1, Tas, a viral transactivator, was that protein. In Arabidopsis, transgenic Tas expression strongly decreased siRNAs and led to developmental anomalies reminiscent of those elicited by suppressors interfering with miRNA functions, such as leaf elongation and serration, suggesting Tas suppresses a fundamental step conserved from plants to mammals shared between the miRNA and siRNA pathways. Like Tas, another protein, AC2, encoded by the DNA plant viruses, geminiviruses, is a viral transactivator that can suppress RNA silencing. "We want to investigate whether transactivation and suppression are linked or completely separate," Lecellier said. Researchers currently think each cell type harbors its own specific miRNA repertoire, Lecellier said. "This idea could partially explain some of the differences in viral permissivity observed between specific tissues," he said, with viruses preferentially replicating in cell types where antiviral miRNAs are not expressed or are only weakly expressed. A miRNA response could also lead to the emergence of viral quasispecies, as viruses that can rapidly introduce synonymous mutations into their genomes, such as HIV or influenza, do so to evade silencing by miRNA. "The emergence of quasispecies is important for resistance to antiviral strategies, so studying this miRNA response could be important for studying resistance," Lecellier said. The team saw no evidence that human cells used siRNAs to disable viruses. "So it'd be interesting to investigate whether or not mammals have lost the ability to respond to viruses using siRNAs because they have a more advanced immune system than plants and flies and worms," said Phillip Zamore at the University of Massachusetts, who did not participate in this study. It was uncertain whether the miRNAs were part of a dedicated antiviral response or whether they accidentally silenced viral RNA, he said. "It'd be interesting to see whether expression of miRNAs are vastly upregulated in viral infection," he told The Scientist. Future directions should involve testing any of the several hundred human microRNAs against viruses such as HIV and influenza, said Shou-Wei Ding at the University of California at Riverside, who did not participate in this study. "Also, they studied this in cell culture, and it'd be interesting to look at this at the whole animal level," Ding told The Scientist. Links for this article C. Lecellier et al., "A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells," Science, 308:557-60. April 22, 2005. http://www.sciencemag.org Charles-Henri Lecellier http://www.sigu7.jussieu.fr/B2M/pages/doc/2K4/virord11va.html A.J. Hamilton, D.C. Baulcombe, "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants," Science, 286:950-2, October 29, 1999. [PubMed Abstract:http://www.biomedcentral.com/pubmed/10542148/] H. Li et al. "Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus," Science, 296:1319-21, May 17, 2002. [PubMed Abstract:http://www.biomedcentral.com/pub ... com/pubmed/12016316] C. Lecellier, A. Saib. "Foamy viruses: between retroviruses and pararetroviruses," Virology, 271:1-8, May 25, 2000. [PubMed Abstract:http://www.biomedcentral.com/pub ... com/pubmed/10814564] Phillip Zamore http://www.umassmed.edu/bmp/faculty/zamore.cfm Shou-Wei Ding http://www.cepceb.ucr.edu/members/ding.htm 据《科学》杂志4月23日报道，MicroRNA在人体发育过程中起着意想不到的作用。 法国科学家称核糖核酸沉默机制（RNA silencing）能够抵抗人体中的病毒，不可思议的是，小RNA (miRNA)竟然是组成这一机制的基础。 “科学家一直认为miRNA与调节内源基因有关，而小分子干扰核糖核酸（iRNA）能够控制外源基因，尤其是病毒RNA基因，”该文的主要作者、来自法国斯特拉斯堡的植物分子生物学院的查利斯·亨利·莱西利亚在《科学》杂志上说道。 科学家们先前的研究显示，核糖核酸干扰（RNAi）能够消灭植物以及昆虫体内的病毒，但目前还没有研究表明它在脊椎动物也拥有类似功能。自从科学家们发现RNA沉默机制能够压抑内生反转录病毒，使其无法在植物、酵母、蚯蚓以及苍蝇等等体内游动，莱西利亚和他的同事就推断哺乳动物体内的外源病毒基因的反转录移位功能应当也是同样脆弱。因此他们选择了一种原始的1型泡沫病毒（PFV-1）——一种与人体免疫缺损病毒（HIV）同类的逆转录酶病毒——作为实验的模拟系统。 由于P19沉默干扰基因的表达，PFV-1病毒在人工“人体胚胎肾脏细胞株”（human embryonic kidney cells）中聚集并且变得十分明显。这意味着，由于P19细胞控制着siRNA和miRNA，而且这两种核糖核酸的路径也控制着PFV-1在人体细胞中的繁殖。 为了确定人体RNA沉默机制的具体作用，研究者们将PFV-1病毒所含有的病毒基因序列与一种附有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）链接在一起，然后使它们与人体胚胎肾脏细胞一起染上病毒。报告显示，F11架构中的绿色荧光蛋白与F11mRNA聚集中所含有的绿色荧光蛋白比例完全不同。这一点使研究者们想到了miRNA转录抑制。利用DIANA-microT运算法则计算后发现F11序列与人体miR-32具有高度的相似性。 进一步的研究表明，miR-32沉默受到P19表达细胞的压抑。同样，受抗miR-32细胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病毒的繁殖量增加了一倍，并不是像抗miR-32细胞所起的作用一样。这意味着miR-32起着直接反病毒作用。 植物与昆虫中，所有的核糖核酸干扰（RNAi）能够消灭的病毒都含有可以抑制核糖核酸沉默的蛋白质。而在后来的研究结果显示，PFV-1中含有一种叫做Tas的病毒反激活蛋白。 一种叫做“阿拉伯芥”的植物中，转基因Tas能够大量减少siRNAs，并且使干扰基因引发的细胞产生发育变异现象，同时干扰miRNA的功能，例如植物叶子变长、长出锯齿等。这意味着Tas具有抑制miRNA 和siRNA某种基本功能的作用，而这种功能是植物与哺乳动物共同拥有的。 类似Tas的另一种蛋白质，AC2，其中含有植物基因病毒，也是一种病毒反激活蛋白，同样能够压抑RNA沉默机制。 目前，研究者们认为每种类型的细胞都有自己独有的miRNA细胞库。莱西利亚说：“这样的概念能够部分解答一些有关病毒反应方面的问题。”他认为，在细胞种类中，优先繁殖的病毒是处在抗病毒miRNAs没有表现的地方，或者表现并不明显的地方。 MiRNA的反应也会导致基因准种群出现，如果病毒能够快速使其基因组发生变异，例如HIV与流感病毒，它就能避免受到miRNA沉默机制的影响。“基因准种群的出现对于躲避抗病毒功能的影响是十分重要的，因此研究这种miRNA反应也十分重要，” 莱西利亚说。 这一研究小组并没有发现人类细胞能够利用siRNA来消灭病毒。“所以研究哺乳动物是用还具有利用siRNA来对付病毒的能力是一个十分有趣的课题，因为与蚯蚓、苍蝇这些昆虫相比，哺乳动物拥有更加先进的免疫系统，”麻省理工大学的飞利浦·赛摩说。他并没有参加这次研究活动。虽然miRNAs是否是抗病毒反应的原因之一，或者只是偶然对病毒核糖核酸起到了沉默作用，但是他认为：“不论miRNAs的表达是否会抑制病毒传染，这项研究都会引起科学界的广泛关注。” 美国加州大学的丁守维（音译）称，未来的研究方向可能会包括测试几百个人体microRNAs对诸如HIV病毒和流感病毒等病毒的反应，他也未参加此次研究。他说：“他们已经在细胞培养室做了试验，如果在动物身上做相关实验的话会引起科学界更大的关注。” 法国研究人员发现，哺乳动物细胞能关闭入侵的病毒。当病毒感染细胞后，它把自己的基因插入细胞的基因组，这样在细胞复制时也产生许多的病毒拷贝。研究人员已经知道植物和昆虫用RNA干扰使病毒基因沉默，在这个过程中，小的RNA分子将自己插入到基因表达机器中使某个基因沉默。动物也将RNA干扰用在一个调节功能上：它们在发育过程中通过RNA干扰改变自己基因的表达。Charles Henri Lecellier和同事现在发现，人类细胞也用RNA干扰来阻碍一个侵袭哺乳类的病毒的积累。 引用链接地址：http://www.bioon.com/biology/showarticle.asp?ArticleID=102462 |
5楼2005-06-06 09:17:49
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6楼2005-06-06 09:31:34
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质粒稳定性测试(Plasmid stability test)
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Immediately before indcution, it is advisable to test the culture to determine the fraction of cells that still carry the target plasmid. This involves plating of cells on four different plates. Plate cells that grow on these plate LB plate all viable cells LB plate + antibiotic cells that still carry the plasmid LB plate + IPTG (1 mM) cells that have lost the plasmid or mutants that have lost the ability to express the target gene LB plate + antibiotic + IPTG (1 mM) only mutants that retain the plasmid but have lost the ability to express the target gene Remarks In the presence of IPTG, cells carrying a protein production plasmid do not grow because have dedicated all their resources to the production of the recombinant protein instead of cell maintainance. In the presence of the pLysS vector, IPTG also prevents colony formation except with certain vector (such as pET-3 and some vectors carrying the T7lac promoter). In the presence of pLysE, IPTG usually does not prevent colony formation unless the target protein is toxic. In a typical culture useful for producing target protein, almost all cells will form colonies both on the LB plate and on the LB plate + antibiotic; less than 2% of the cells will form a colony on the LB plate + IPTG; and less than 0.01% will form a colony on the LB plate + antibiotic + IPTG. With unstable target plasmids, the fraction of cells that have lost the plasmid will be reflected by an increase in colonies on the LB plate + IPTG and a decrease on ther LB plate + antibiotic. Protocol 1. Immediately before induction with IPTG (at OD600 is approx. 0.6), take a 100-ml aliquot of the cell culture. 2. Make a serial dilution of the cell suspension, including a 105 and 106 dilution. 3. Plate cells at a dilution of 105 on the LB plate + IPTG and on the LB plate + IPTG + antibiotic. Plate cells at a dilution of 106 on the LB plate and on the LB plate + antibiotic. 4. Incubate the plates overnight a 37°C. 5. Count the number of colonies on each plate. Reference: pET System Manual, 8th ed., 1999 (Novagen). |
7楼2005-06-06 09:37:04
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9楼2005-06-06 20:30:40
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