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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白纯化不挂柱
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悦赏花开花落

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 穿白大褂约会 at 2015-10-11 21:46:20
1、最好是将上清纯化；复性包涵体毕竟回收率不能保证。2、如果不挂柱，换个厂家的Ni柱也许就挂柱了，当时我也有这种情况的蛋白，换了一家Ni柱就有60%挂柱了！

你好，请问你是换的哪家的填料?

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11楼2015-10-12 12:37:29
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悦赏花开花落

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by Bio-Way at 2015-10-12 00:22:37
你好，N端His-tag蛋白不挂NI柱，是一种比较常见的蛋白纯化问题，有多种方法可以去尝试，建议找专业高效的蛋白表达纯化公司咨询。
吐露港生物已成功构建完整的大肠杆菌原核和酵母细胞真核的蛋白表达技术平台，并可以 ...

可否简单说一下有什么方法嘛？

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12楼2015-10-12 12:44:33
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
His蛋白纯化不挂柱可能是存在以下问题：
1.Ni柱本身的问题，建议重新装柱子，以确保Ni柱的效率。
2.既然不加咪唑，蛋白的结合也存在问题，那么就要考虑降低盐浓度。
3.还有一点就是从破菌到Ni柱上样，不能还有EDTA。
4.最坏的就是你的蛋白质在折叠的过程中将C端的His-tag包埋了，这样的话，你就要重新构建了。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
13楼2015-10-12 15:06:11
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黄金闪闪亮

铜虫 (小有名气)
好艰深，纯属打酱油
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14楼2015-10-12 15:47:43
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RyanKai

新虫 (小有名气)
同求，我的表达在上清量很大，可是纯化也是不挂柱，不知道为什么
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15楼2017-08-29 18:13:37
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

可能你的His标签被包裹，需要用包涵体的复性和纯化方法进行。
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16楼2017-10-23 11:43:29
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

可以尝试用8M尿素溶解包涵体，用IMAC的镍柱纯化，含尿素上样平衡，不含尿素清洗，不含尿素加咪唑洗脱，纯化复性同时进行。
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17楼2017-10-31 15:29:26
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