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zljuile0713木虫 (小有名气)
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[求助]
不用试剂盒扩5’3’求指教！已有1人参与
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| 最近在看有关5’、3’克隆的东西，据说可以不用试剂盒进行克隆，大概意思是在反转录的时候加个什么引物就可以获得用于后期克隆的模版。可是这个原理是什么一直搞不明白，这种加接头是普通反转录酶就能实现吗？比如takara的反转录试剂盒就可以实现吗？那加接头的原理是什么呢？求路过的大神指教！！万分感谢🙏🙏🙏 |
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jackyoung
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2楼2015-10-07 11:17:21
卡西西VS鸣人
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【答案】应助回帖
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zljuile0713: 金币+100, ★★★★★最佳答案 2015-10-08 08:27:37
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对于RACE来说，5末端相对要比3端难得到的多，有一种经典3‘race的方法 所需引物： QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTT TTTTTTT Q0：CCAGTGAGCAGAGTGACG（是QT前面的一部分） Q1：GAGGACTCGAGCTCAAGC （是QT中间的一部分） 基因特异性引物：GSP1，GSP2 （正向引物） 以QT引物替代平时用的Oligo dT引物进行反转录得到cDNA第一链，以Q0引物与GSP1进行外向PCR，以Q1引物与GSP2进行内向PCR，这样就能得到目的片段,琼脂糖检测连T载体测序即可。 这种方法其实就是很多分子生物学书的经典RACE的方法，其实5-RACE也可以这样做，就是反转录后在cDNA第一链末端加上A,然后就可以用QT,Q0,Q1分两次进行巢式PCR就行,我用这种方法已经得到好几个全长基因了. 另外,这种方法对RNA的质量要求也不是很高,我提的RNA质量就不太好,只要主带明显,没有DNA残留就可以,稍微有些降解也没有问题. 一般来说做race比较好的试剂盒是smart，但是比较贵，下面是它的步骤： First-strand Synthesis SMART II A Oligonucleotide (10 μM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3' 3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 10 μM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N–3' (N = A, C, G, or T; N-1 = A, G, or C) 5'-RACE CDS Primer (5'-CDS;10 μM) 5'–(T)25N-1N–3' (N = A, C, G, or T; N-1 = A, G, or C) Long (0.4 μM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Short (2 μM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3' Nested Universal Primer A (NUP; 10 μM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Primer Sequence Gene-Specific Primers (GSPs) should be: • 23–28 nt • 50–70% GC • T m ≥ 65°C; best results are obtained if Tm > 70°C (enables the use of touchdown PCR) 1. Combine the following in seperate 0.5-ml microcentrifuge tubes: For preparation of For preparation of 5'-RACE-Ready cDNA 3'-RACE-Ready cDNA 1–3 μl RNA sample 1–3 μl RNA sample 1 μl 5'-CDS primer 1 μl 3'-CDS primer A 1 μl SMART II A oligo 2. Add sterile H2O to a final volume of 5 μl for each reaction. 3. Mix contents and spin the tubes briefly in a microcentrifuge. 4. Incubate the tubes at 70°C for 2 min. 5. Cool the tubes on ice for 2 min. 6. Spin the tubes briefly to collect the contents at the bottom. 7. Add the following to each reaction tube (already containing 5 μl): 2 μl 5X First-Strand buffer 1 μl DTT (20 mM) 1 μl dNTP Mix (10 mM) 1 μl PowerScript Reverse Transcriptase 10 μl Total volume 8. Mix the contents of the tubes by gently pipetting. 9. Spin the tubes briefly to collect the contents at the bottom. 10. Incubate the tubes at 42°C for 1.5 hr in an air incubator. 11. Dilute the first-strand reaction product with Tricine-EDTA Buffer: 12. Heat tubes at 72°C for 7 min. 13. Samples can be stored at –20°C for up to three months. 你可以参照其3’race，设计引物。但是5‘race，需要你买特殊的反转录酶M-MLV Reverse ,具有在末端加CCC的特征，试剂盒中的SMART II A Oligonucleotide是RNA，可以用单链的DNA代替，即合成普通的引物就行。 还有一种是在DNA水平在扩5’末端，然后自己分析去除内含子（Liu and Chen 2007） 用的热不对称法根据克隆得到的苹果蠹蛾PBP2基因cDNA片段序列，以待扩增的5'末端为方向设计3条嵌套的特异性引物，引物RB-1设计位置在RB-0内侧，RB-2位于RB-1内侧，这3条引物分别为第1至第3轮反应的下游引物。引物LAD1到LAD4为上游简并引物，用于第1轮扩增的4个平行反应；AC1（Liu and Chen 2007）作为第2和第3轮扩增反应的上游引物。 LAD1 ACGATGGACTCCAGAGVNVNNNGGAA LAD2 ACGATGGACTCCAGAGBNBNNNGGTT LAD3 ACGATGGACTCCAGAGVVNVNNNCCAA LAD4 ACGATGGACTCCAGAGBDNBNNNCGGT AC1 ACGATGGACTCCAGAG RB0 Sp1 RB1 Sp2 RB2 Sp3 整个TAIL-PCR反应过程分为3轮：预扩增反应（Pre-amplification）由10个高温循环、1个低温循环、25个较高温循环构成。前10个高温循环是单线性扩增，以增加特异模板的比例，随后的1个低温循环使简并引物结合到较多的目标序列上，25个较高温循环使两种引物均能与模板退火；第1轮反应（Primary TAIL-PCR）将上一轮反应的PCR产物稀释50倍作为模板，通过数次2轮高温、1轮低温的热不对称循环，使特异性产物被选择性地扩增，降低非特异性产物的比例；第2轮反应（Secondary TAIL-PCR）将上一轮反应的PCR产物稀释10倍作为模板，以普通的PCR反应或热不对称循环扩增特异性产物。反应体系及PCR反应具体程序如下： （1）TAIL-PCR反应体系 Pre-amplification（20 ul）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.0 ul， dNTP Mix（各2.5 mM）2 ul，任1种LAD引物（20 uM）1 ul，引物RB-0（10 uM）1 ul，DNA模板1 ul，Ex Taq 酶（5 U/ul）0.2 ul，dd H2O补足至20 ul。 Primary TAIL-PCR（25 ul）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.5 ul， dNTP Mix（各2.5 mM）2 ul，引物AC1（10 uM）1 ul，引物RB-1（10 uM）1 ul，DNA模板（预扩增产物稀释50倍）1 ul，Ex Taq 酶（5 U/ul）0.25 ul，dd H2O补足至25 ul。 Secondary TAIL-PCR（25 ul）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.5 ul， dNTP Mix（各2.5 mM）2 ul，引物AC1（10 uM）1 ul，引物RB-2（10 uM）1 ul，DNA模板（上一轮扩增产物稀释10倍）1 ul，Ex Taq 酶（5 U/ul）0.25 ul，dd H2O补足至25 ul。 反应程序请参照：Liu Y G, Chen Y L. 2007. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Bio Techniques, 43 (5): 649~656 |
3楼2015-10-07 12:27:01