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liumikewolf

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 彬哲 at 2008-9-3 07:45:
酶切反应系统包括:DNA,酶,buffer,灭菌水。
不同公司的酶和buffer系统是不同的,所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer(常识)。NEB和promega的酶都不错的,我们常用的酶是NEB(new england biolabs)公 ...

我实验中,需要把5.3kb的双切,回收5.1kb的片段,但是切下来的200的小片段始终看不清楚,不知道是什么原因!如果看不清小片段部分,是否就是酶切失败?
这种情况怎么确定酶切是否成功?体系:
      90微升质粒,
      10微升酶1
      10微升酶2
      40微升缓冲液加BSA
      50微升水
因为另外有对照双切效果很好,所以酶本身没有问题.请多指教!!!
21楼2008-11-11 09:20:23
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gncaas

金虫 (小有名气)

  有帮助,顶一下
22楼2008-11-11 10:20:19
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xiazi221

铜虫 (小有名气)

谢谢楼主,酶切不太好做,学习
23楼2008-11-11 10:24:42
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xiazi221

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by liumikewolf at 2008-11-11 09:20:



我实验中,需要把5.3kb的双切,回收5.1kb的片段,但是切下来的200的小片段始终看不清楚,不知道是什么原因!如果看不清小片段部分,是否就是酶切失败?
这种情况怎么确定酶切是否成功?体系:
      90微升质粒, ...

你可以做一个对照试验,2管DNA,一管酶切,一管不加酶,看看跑出的带是否一样大。如果酶切的的片段比没有酶切的片段小,就说明酶切成功了,不需要非得看到200bp的小片段啊。个人见解
24楼2008-11-11 10:57:11
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聂子3388

铜虫 (小有名气)

很感激  很受用  谢谢
25楼2008-11-11 10:58:39
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26楼2008-11-12 00:21:41
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

30楼的兄弟,5.3kb和5.1kb的差距电泳很难判定啊.
我想marker中的小片段经常会检测不到,酶切产生的200小片段恐怕也是这种情况!
27楼2008-11-12 08:53:45
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石头1798

新虫 (初入文坛)

请教!

EDTA是钙离子和镁离子等二价金属离子的螯合剂,作用是:抑制DNase的活性,抑制微生物生长,怕DNA会迅速被降解。所以后面的TE缓冲液中含有EDTA。
   可
楼主却说   DNA,自己制备的DNA,样品中不应该有酚,氯仿,酒精,                EDTA,                         盐离子等的污染,这些东西会影响酶的活性。这个问题应该在提质粒阶段避免。
  问题:怎样避免EDTA,矛盾吧!
28楼2008-11-12 15:21:26
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棋宴

新虫 (初入文坛)

谢谢LL!!!
很好!!!
29楼2008-11-24 22:56:02
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