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liumikewolf

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Originally posted by 彬哲 at 2008-9-3 07:45:
酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水。
不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer（常识）。NEB和promega的酶都不错的，我们常用的酶是NEB（new england biolabs）公 ...

我实验中,需要把5.3kb的双切,回收5.1kb的片段,但是切下来的200的小片段始终看不清楚,不知道是什么原因!如果看不清小片段部分,是否就是酶切失败?
这种情况怎么确定酶切是否成功?体系:
   90微升质粒,
   10微升酶1
   10微升酶2
   40微升缓冲液加BSA
   50微升水
因为另外有对照双切效果很好,所以酶本身没有问题.请多指教!!!

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21楼2008-11-11 09:20:23

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gncaas

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22楼2008-11-11 10:20:19

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xiazi221

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谢谢楼主，酶切不太好做，学习

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23楼2008-11-11 10:24:42

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xiazi221

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引用回帖:

Originally posted by liumikewolf at 2008-11-11 09:20:

我实验中,需要把5.3kb的双切,回收5.1kb的片段,但是切下来的200的小片段始终看不清楚,不知道是什么原因!如果看不清小片段部分,是否就是酶切失败?
这种情况怎么确定酶切是否成功?体系:
90微升质粒, ...

你可以做一个对照试验，2管DNA，一管酶切，一管不加酶，看看跑出的带是否一样大。如果酶切的的片段比没有酶切的片段小，就说明酶切成功了，不需要非得看到200bp的小片段啊。个人见解

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24楼2008-11-11 10:57:11

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聂子3388

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很感激很受用谢谢

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25楼2008-11-11 10:58:39

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bacillus1788

26楼2008-11-12 00:21:41

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liumikewolf

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30楼的兄弟,5.3kb和5.1kb的差距电泳很难判定啊.
我想marker中的小片段经常会检测不到,酶切产生的200小片段恐怕也是这种情况!

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27楼2008-11-12 08:53:45

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石头1798

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请教！

EDTA是钙离子和镁离子等二价金属离子的螯合剂，作用是：抑制DNase的活性，抑制微生物生长，怕DNA会迅速被降解。所以后面的TE缓冲液中含有EDTA。
可
楼主却说 DNA，自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精， EDTA，盐离子等的污染，这些东西会影响酶的活性。这个问题应该在提质粒阶段避免。
问题：怎样避免EDTA，矛盾吧！

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28楼2008-11-12 15:21:26

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棋宴

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谢谢LL!!!
很好！！！

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29楼2008-11-24 22:56:02

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