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彬哲

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 关于酶切的一点经验

酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水。
不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer（常识）。NEB和promega的酶都不错的，我们常用的酶是NEB（new england biolabs）公司生产的酶。使用前应该阅读NEB公司的产品目录和该酶的使用说明。下面分几个方面简要说明：
1，DNA，自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，这些东西会影响酶的活性。这个问题应该在提质粒阶段避免。
2，酶，酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。（因为酶是储存在50％甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5％就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置）。如果切点位于线状质粒两端，酶切效率将会大大降低。
3，buffer，不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer，有些buffer中需要另外添加BSA，不要忽略了哦。
4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。
5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。
6，电泳检测。条带不清楚跟电泳也有关系。首先是胶的浓度，不同浓度的胶适合分离不同大小的片段，这个你看看分子克隆之类的书，一般来说，1％的gel可以用于500bp－6，7kb的片段分离。其次是电压，电压不能太高。这些你肯定都很清楚，我就不赘述了。还有如果载体很大，而切下来的片段很小，那么切下来的片段就会因为质量小而不容易看清楚，比如从10kb的载体上切下来200bp的片段这种情况，解决方法就是多切一些，再点marker仔细看。
7，双酶切。因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况：1）两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。2）两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm网站也有建议。
这个网站也可仔细看看啊，总之熟能生巧，实验肯定是越做越好的。
BEST WISHES

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