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当PACBIO遇到出微生物多样性16S rDNA全长测序服务
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16S rDNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。该基因序列足够长（包含约50个功能域）且具有高度的保守性和特异性。16s rDNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。随着数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。然而，受二代测序的读长限制，目前的微生物多样性研究仅检测16S rDNA的某几段高变区，物种分类也只能精确到“属”的水平。 16s作为鉴定物种分类的“分子钟”基因，目前采用二代测序虽然可以测其保守区，但区分度一直受测序长度影响。而三代平台的PacBio RS II的平均读长为10-14Kb，16S rDNA长度大约为1500bp左右，因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列,这样在微生物鉴定方面注释信息可靠度会更为精确。 测序原理 首先，Adaptor（SMRTbells）加到扩增子的两端。 然后测序引物与SMRTbells退火。紧接着DNA聚合酶结合到复合体上。 随后聚合酶-扩增子-adaptor组成的复合体被固定到ZMWs中进行复制，产生核苷酸特异性的荧光信号。CCS使得聚合酶对环形链进行扩增，产生具有随机错误的长读长序列。 运行结束后，去除接头（SMRTbell），单分子末端补齐，产生一条序列，CCS测序结果的单分子覆盖度和准确度取决于扩增子和序列长度，扩增子越小，读取长度越长，单分子覆盖度和准确度就越高。 |
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