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Longnil

新虫 (小有名气)

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[交流] 农药降解菌阳性克隆子的筛选及鉴定已有1人参与

农药降解菌阳性克隆子的筛选及鉴定，这个试验是从今年年初就开始的，直到今天我才找到了阳性克隆子并对其进行鉴定。在此讲述下我做实验的整个流程，给同方向的虫友提供参考。
   在阳性克隆子的筛选上，我选择了透明圈和抗生素两个筛选标记。起初野生菌在农药平板上透明圈上还是很明显的，可将转化子涂在农药板上根本分辨不出哪个菌落周围是有透明圈的（要么全都像有透明圈，要么全都像没有圈的），就这样硬着头皮做了十多次转化后也没找到有透明圈的转化子。之后我改成了盲挑：将每个克隆子分别挑至3mL LB试管中并编号，培养好后十个为一个单位转至10mL mm中做液体验证（例如将编号为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10的菌液各取100微升离心后转移至mm中验证是否能降解农药），如果某一瓶中农药被降解就分别对这10支试管中的菌液进行液体验证这样就可以找到具体是哪个菌液有降解效果，为进一步验证其降解能力将有降解效果的菌液划线至抗生素平板上（一定要加抗生素！！），挑取单菌进一步验证其降解效果。另一方面，通过单酶切和双酶切质粒进一步鉴定插入片段是否正确，最后送去测序。
   在这个试验过程中我犯了一个很严重的错误，导致试验拖延了两个多月：克隆子培养过程中忘记加抗生素，导致在传代验证过程中假阳性克隆子的大量出现和菌液的污染，曾4次与阳性克隆子擦肩而过（从做转化开始到验证克隆子能否降解农药这个周期大概13天）
   今年是我进实验室的第三个年头了，这三年中，我经历了很多次试验的失败，这其中很大一部分是因为在面对试验结果时没有做出正确的判断没把握好下一步的实验方向。三年中历练了很多也成长了很多，希望以后会更好。

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