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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求细菌蛋白提取的方法以及三SDS-PAGE的实验方法和原理
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llvi

金虫 (小有名气)

[交流] 求细菌蛋白提取的方法以及三SDS-PAGE的实验方法和原理

求细菌蛋白提取的方法以及三SDS-PAGE的实验方法和原理，想详细学习一下，谢谢
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1楼 2008-08-28 13:30:24
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

SDS-PAGE

【实验原理】
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小以及，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：

式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白质的分子量，简便、快速、重复性好，只需要廉价的仪器设备和微克量的蛋白质样品；在分子量为15000～200000的范围内所测得的结果与用其他方法测得的分子量相比，误差一般不超过10%。
SDS-PAGE也有不足之处，尤其是电荷异常或结构异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构蛋白等测出的相对分子质量不太可靠。尤其对一些由亚基或两条以上肽链组成的蛋白质，由于SDS及DTT的作用，肽链间的二硫键被打开，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或单条肽链的相对分子质量，而不是完整蛋白质分子的相对分子质量，故还需要其他方法测定其相对分子质量及分子中肽链的数目等参数，与SDS-PAGE结果相互验证。
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度均不连续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

【试剂与仪器】
试剂：
（1）分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液 pH8.8）：取1mol/L盐酸25mL，Tris 18.2g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl缓冲液 pH6.8）：取Tris 6.0g，加入约50ml去离子水溶解，用1mol/L盐酸调至pH6.8，用去离子水定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
（5）10% SDS溶液：取SDS 10g，溶于100mL蒸馏水。
（6）1% TEMED：取1mL TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺），用去离子水稀释至100mL，避光冷藏。
（7）10%过硫酸铵（AP）：取过硫酸铵1g溶于10mL蒸馏水，现用现配。
（8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液 pH8.3）：称取Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，加入10％ SDS溶液5mL，用无离子水溶解后定容至500mL。
（9）Loading Buffer：先配制0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：取0.61g Tris，加50ml蒸馏水溶解，再加入3mL 1mol/L的HCl，后调pH为8.0，定容至100mL。后取10％ SDS 4mL，DTT 0.3085g，甘油2mL，溴酚蓝4mg，0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液4mL，定容至20mL，4℃避光保存。现用现配。
（10）固定液-染色液：1.25g考马斯亮蓝G-250，加入227mL 甲醇溶液、46mL冰乙酸和227mL蒸馏水。
（11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL蒸馏水与50mL甲醇混匀。
仪器用具：
垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50和100ul移液枪和枪头；玻璃板；水浴锅；染色槽；烧杯；吸量管。

【实验步骤】
（1）装板，将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模取出，其中有长玻璃板和短玻璃板各一块。在这两块干燥洁净的玻璃板之间夹入一块1.5mm厚的U形垫片，将左、右、底三边嵌入U型橡胶框中，使长玻璃板下沿与橡胶框之间露有2～3mm缝隙，将来制胶时以保证此端的凝胶与一侧的电极槽相通，而短玻璃板的下沿则插入橡胶框的底槽内。由此便构成一个“夹芯式”凝胶腔。把上述装配好的凝胶腔置于仰放的电极上槽（白金丝在上方的“半池”），使凝胶腔底部有狭长缝隙的一面向上。合上电极下槽（白金丝在下方的另一“半池”）。使三个对位销子全部进入销孔，用四条紧固螺栓把以上叠放好的电泳池夹紧从而串成一体。将这种垂直板型电泳装置垂直放置在水平台面上，准备灌出胶液。
（2）配胶：按表所列试剂用量分别配制8％分离胶胶液和5％浓缩胶胶液。
加样顺序        试剂名称        30ml不同浓度凝胶液所需试剂量（单位：ml）
                5％浓缩胶        8％分离胶
1        凝胶贮备液        5（10％浓缩胶贮液）        8（30％分离胶贮液）
2        凝胶缓冲液         2.5（10％浓缩胶贮液）        7.5（30％分离胶贮液）
3        10％SDS溶液        0.1        0.3
4        1％TEMED        0.8        2
5        蒸馏水        1.5        12
以上各液加入后用玻棒稍加搅动使得混合均匀，为了去除抑制凝胶聚合的氧气，最好在灯泡瓶内配胶并在10％过硫酸铵加入之前抽气处理约10分钟
6        10％过硫酸铵        0.1        0.2
（3）凝胶液的灌注和聚合：将所配制的分离胶胶液沿着凝胶腔的长玻璃板的一面缓缓倒入或用滴管滴入凝胶腔内，直至8cm左右的高度处为止，然后用滴管沿凝胶腔内壁缓缓加入蒸馏水进行水封，20分钟后水封层与分离胶胶层之间出现明显界面表示分离胶和聚合完成。倾去水封层，并用无毛边的滤纸吸去胶面上残留的水液。以同样的灌注方式将所配制的浓缩胶胶液注入凝胶腔内的分离胶上面，浓缩胶的高度约为2.5cm，或将浓缩胶胶液加至距凝胶腔短玻璃板上沿约1cm处为止（短玻璃板的高度总计为11.5cm）。立即将梳形样品槽模板插入胶液顶部，插入梳形样品槽模板的目的是在胶液聚合后使凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽，电泳前将样品液加在这些凹槽内。撞齿的宽度以及齿与齿的间隔可随需要而定。浓缩胶胶液的聚合时间约为20分钟。聚合完成后即可拔去梳形样品槽模板。
    （4）加样：为了避免边缘效应，前后各两个样品槽不上样。
（5）电泳：先用100V电泳，至溴酚蓝指示剂到达两种胶的界面处，加大电压，待指示剂移动到底边1cm处停止电泳。
    （6）固定与染色：为了节省时间，固定与染色一步进行。用镊子撬开短玻璃板，取出胶，用固定-染色液浸泡。
    （7）脱色：染色后，弃染色液，用蒸馏水漂洗胶数次，后加入脱色液浸泡扩散脱色。经常更换脱色液，直至信噪比为最大。




word的格式贴过来有点乱

其实，SDS-PAGE教科书不应该很多？
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3楼2008-08-28 14:40:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
llvi(金币+10,VIP+0):写了，不过最后的原理貌似教课书上的啊
细菌总蛋白用SDS裂解法~~~
（1）摇匀培养液后取1mL于离心管中，10000rpm离心10min。
（2）移去上清，剩下约50ul左右，加入少量pH 7.4 PBS洗涤三次，留下50ul左右。
（3）加入50uL Loading Buffer、0.31g DTT振荡使沉淀悬浮。
（4）将离心管置于100℃中水浴10min。
（5）12000rpm离心5～10min，上清即为抽提出来的蛋白。
（6）将上清移到新的离心管，补加少量Loading Buffer（约5ul）即可上样。

其中Loading buffer的配方是：
先配制0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：取0.61g Tris，加50ml蒸馏水溶解，再加入3mL 1mol/L的HCl，后调pH为8.0，定容至100mL。后取10％ SDS 4mL，DTT 0.3085g，甘油2mL，溴酚蓝4mg，0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液4mL，定容至20mL，4℃避光保存。现用现配。
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2楼2008-08-28 14:38:47
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sxxuan

金虫 (著名写手)
还要看实验室所用的电泳槽是怎样的，不同的电泳槽装或是封胶时有点不同
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你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2008-08-28 18:38:46
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