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hufan1007铁虫 (初入文坛)
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[求助]
求助 乙酰胆碱酯酶具体的活性测定方法，急，谢谢
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我是这样测的 用Ellman 法测其活性：乙酰胆碱酯酶0.001g/ml， 底物氯化乙酰胆碱0.01 g/ml DTNB 4 mg/ml （用Tris-甘氨酸缓冲液 ph 8.0 溶解） 取100ul底物加到100ul酶溶液中，反应一段时间后加入100ul DTNB ,放置37°反应。应产生蓝色沉淀。但是结果没产生蓝色沉淀，请问大家这是怎么回事？是不是我实验步骤有问题啊？ |
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1012203014
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 |
2楼2015-10-07 21:12:43