胺基树脂柱使用维护指南手册
目 录
1树脂色谱柱的介绍
2柱子结构
2.1拆箱
2.2 清洗液的制备
3 柱子的保护
3.1安装指南
3.2 清洗指南
4 固定相
5 操作参数
5.1 流速
5.2 样品分离
5.3 压力控制
5.4 测试
6 再生步骤
6.1树脂床蓬松
6.2清洗污染的柱子
6.3 柱子恢复到原始离子状态
6.4
6.5仪器调整/ 连接管道问题
7 加热柱关闭
8柱子保存
8.1 长期保存
8.2 短期保存
9 故障检修
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第一部分：
树脂基HPLC（高效液相色谱）色谱柱介绍
树脂基HPLC色谱柱依据离子排斥、离子交换、配体交换、粒度排斥、反相和正相分配原理。多重模式和交互作用提供了分离物质的独特的能力。树脂的装填使柱子有离子交换的能力。聚苯乙烯的骨架提供了疏水的相互作用。相互作用的程度取决于待分析的化合物和要求的选择性程度。
要达到有效分离，反相和离子对HPLC技术要求复合洗脱剂条件。这些方法建立在待分析化合物的改性上，直到对柱子适合为止。对于树脂基的HPLC柱，可以通过改变填充的材料及优化色谱条件实现化合物的分析。因此，树脂基柱也可用于异构体的HPLC体系，简化样品的制备方法，同时要求样品没有衍生作用。通过缩短样品的制备时间，树脂基柱大大缩短了总的分析时间，但是对于大部分的分离，样品制备时必须进行过滤。
柱子是高效液相色谱的核心。分析的成功与否取决于合适的操作条件选择及柱子的维护保养，不管HPLC系统及样品的制备多么好，如果柱子的使用不当，也得不到好的分离结果。
第二部分：色谱柱结构
2.1拆包
拆包取色谱柱时，仔细检查是否有运输过程中的损害，粗处理或者溶剂泄漏。使用运输过程中的箱子存放柱子。如果发现柱子被损坏的迹象，立即通知运输方，并且联系Bio-Rad公司技术服务部或直接去Bio-Rad公司在当地的办事处。
2.2 准备洗脱液（也就是流动相）
只有新的去离子水、分析纯试剂和高纯度有机溶剂可以用来制备洗脱液。制备好的流动相在使用之前需用0.45μm的过滤器进行过滤以除去可以堵塞系统进口的不溶性微粒。而基线不稳常常是由于流动相不干净引起的。使用前对洗脱液进行充分的脱气处理。
使用真空和超声处理是对流动相进行脱气的最好的方法。仅使用真空脱气也可以，但需要的时间较长。在真空瓶内装有搅拌棒对于溶剂中气体的脱除很有帮助。单纯的过滤并不能除去所有的气体。用来对溶剂进行脱气的瓶子也可用存放溶剂。使用1升的吸滤瓶就可以了。将脱气后的溶剂倒入另一个容器的过程中会使洗脱液中再次混入气体。更换水溶液和有机溶剂过程中进行也可能引起除气。操作前一定要确定两种溶剂均进行了充分的脱气处理。
第3部分
保护柱
对色谱柱的保护成为公认的HPLC技术的一部分已经有很多年了，这是因为它对于分析柱和色谱系统的保护起着重要的作用。Micro-Guard 室不但可以延长分析柱的寿命，还可以保护柱内的样品。影响分离、污染分析柱的的污染物可以在小室中除去。
由于阴离子、阳离子、有机物、不溶物和微粒引起的可能对分析产生的影响可以使用Micro-Guard 室消除。Bio-Rad公司强烈建议使用Micro-Guard 室。
Micro-Guard高效液相色谱柱保护系统包括可处理的安装在标准保护架上的保护室，或者双重的去灰支架的阴离子或阳离子小室。去灰支架在HPX-42A银铵基柱上使用。去灰形式可以在其他使用水为流动相的柱子上使用。
保护柱必须在污染物扩展到分析柱上之前更换。更换频率并没有规定，因为这依赖于样品制备跳进。一般的，柱子应该定期用标准样进行检查。发现分析数据发生变化时应更换保护柱。
3.1安装保护柱
安装保护柱管，拧松支架末端的螺母。使用Parker式 小室开始使用时可以在任何一个方向使用，改变用过的小室的方向可能导致微粒从小室中流出污染分析柱。小室支架到HPLC柱之间连接一断管前移量（参见小室支架介绍）。将保护柱安装到固定支架上，使用两末端螺母紧固确保固定支架的指状梁紧固。额外的紧固是不需要的，这还有可能破坏焊封或支架。不要使用其他仪器紧固焊封。
3.2 吹洗保护柱
使用10～15ml流动相以0.2～0.3ml/min的流速通过保护柱，对于树脂基色谱柱，在开始的一小段时间内，柱末端流出黄色的液体是正常的。这是储存柱子时形成的磺酸盐聚合物。安装新柱子时需重复此操作。此时，分析柱可以安装到Micro-Guard柱上。
第四部分:连接色谱柱
将流速降低到0.2ml/min。移走分析柱末端的螺母，将保护柱出口末端与分析柱入口管相连。连接分析柱与泵，调节泵低速转动以排除柱子入口处的空气。色谱柱中流过大约20ml脱气流动相后停止。当一个新柱子连接到色谱系统使用或测试时，通过流动相时，柱子仅需连接进口末端。这样可以阻止填料粒子或气泡进入到检测池。当柱子出口末端流出清洁、无气泡的液体时，柱子出口就可以与检测池相连了。
色谱柱和监测池之间的连接管尽可能短这一点是很重要的。注射器和色谱柱、色谱柱和检测池之间的连接管内径（直径）应为0.01英寸。 确保正确的提供、收集以及处理废弃的溶剂。检查保护柱和分析柱连接处无泄漏后，将填充物正确的安装后，将色谱柱放到Bio-Rad柱预热器（目录号：125-0425）。打开色谱加热器开关调节到合适的温度。无流动相流动时不要开色谱加热。只要达到设定的温度后就可以提高流速了。用洗脱液平衡柱子，用开始的洗脱液倾斜柱子。
注意柱中不能进入空气。如果确定柱中已经混入空气，降低柱温，反方向旋转柱子，使得溶剂缓慢流过柱子直到空气完全除去。确定系统所有管路的空气被排净后重新正确的连接柱子。
需注意的一点是所有金属管连接均用压紧螺钉（反相螺母）。金属垫圈被永久的逆着管子压紧。确保系统的死体积最小，拧紧装配管、垫圈和nut finger tight。向里推动管子直到末端固定。用1/4’’ 扳手拧紧1/4转。零件只有密封时需要拧的足够紧；若拧的过紧则会减少零件的使用寿命。
第五部分：操作参数
此时，高效液相色谱系统应该在先后用合适的流动相、启动溶剂进行清洗。保护柱以及分析柱均等量处理。流速应该为0.2ml/min。
5.1 流速
缓慢、倾斜的流过氨基柱。只有当柱温上升到操作温度后才可以提高流速。当使用碳水化合物铵基柱时（HPX-87C，HPX-87P，HPX-87N），在接近环境温度时流速不可高于0.3ml/min。首先，在维持较低流速的时候加热柱子，然后，在柱温达到指定的操作温度后，提高流动相的流速。注意不要超过柱子限定的最高流速。但是即使这样，为延长柱子的使用时间，不可以在最大流速下操作。在公开发表的方法中有最佳流速的选择方法，流速也可以依据分离要求而定。很多时候，降低流速可以提高分离度。典型的，使用300mm长的（30cm）氨基柱，当柱后压低于最高水平时，最佳的操作流速为0.5～0.7ml/min。随着使用时间的延长，因此使用柱后压做为确定流速的主要确定因素。对于HPX-87C，HPX-87H和其他HPX-87系列柱来说，标准的流速为0.6ml/min。
5.2 样品制备
由于样品中某些组分可能在某些溶剂中可能不溶，为防止这类问题的出现，经常将样品溶解于流动相中，样品溶液需经过0.45μm的过滤器过滤。
5.3 柱压检查
HPLC泵压范围应该进行调整，因为压力提高（压力高于标准值10～20％）将引起泵的自动关闭。这样可以在偶然压力升高情况下保护系统。某些HPLC泵的传感器在需要的低压下不能调整，在这种情况下，需要额外的维护以确保没有超过压力限制范围。
压力在正常流速下会缓慢升高（1-2分钟）。这种方法在柱上gentle，提供最大寿命且维持分离度和效率。柱子开始使用时全流速使用可以压紧填料并且在进口处产生空白，这将降低柱效。
当柱子首次与HPLC系统相连时，在缓慢运转后的正常流速下操作时需检查压力。系统整体反压力大概为700-1100psi。（注释：一些HPLC泵并没有给出低压下精确的压力数；进样器）。为确定柱后压，参看系统操作压力，断开保护柱和分析柱，看其压力降。压降应该在100-200psi。（注释：在重新连接柱子时，应将泵流速降低，然后在1-2分钟后慢慢调至全流速运转）
如果在使用过程中系统整体压降升高（在洗脱过程中使用高浓度溶剂，引起压降超过正常值），重复上述过程以确定引起这种现象的原因。如果由于保护柱的原因，背压升高很小，系统可以正常操作。如果保护柱压力升高超过新柱压力的150％，应该更换保护柱。
如果系统压力升高是由于柱子的原因，则柱子可能有一部分堵塞了，流速应该减低在操作限制范围内。有时候，背压升高是由于经过长时间的注射样品后，非极性化合物在柱上的吸附量达到最大值。有时候，柱压由于物料块堵塞柱子也会升高。在任何情况下，对柱子进行清洗或反相流动可以降低背压。如果保护系统在适当位置，且小室根据方向改变，污染物吸附的越少，柱子使用过程中背压升高的时间出现的越晚。不要以打开柱子的方法解决背压问题。打开后柱子中的填充相可能会被冲压损坏柱子。
当时用有机调节剂时，使用5％溶液以0.1ml/min的流速操作直到基线平稳。，然后提高有机调节剂浓度至理想值。观测每一根柱子的最大值。第一步使用5％的溶液降低柱内物质的瞬间搅拌和可能的超压。
避免柱压突然骤变。填料可以被压缩，这可能导致托尾和拄效下降。
5.4 柱测试
所有的新柱子应该在使用之前进行测试，以确定其性能正常。使用时间长了以后，柱性能可能会变化。需要进行重新测试。为得到可靠的分析，效率（理论板数）和选择性（分离度）需能达到需要的最小值。
HPLC系统的性能应该和独立于色谱柱进行验证。因为每根柱子只是在运输前进行检查，而不能反映提供的色谱硬件或流动相的问题。应确保柱子额外体积最小。效率降低经常由于管子会注射器问题引起。如果分离峰与提供的色谱图显著不同，应该仔细检查每种物质，重新配置流动相。
如果洗脱峰顺序和峰形与测试色谱图类似，但是物质并没有完全溶解，应该调整流动相和其他的色谱法变量可能会得到最优的分离或者改善溶解性。当所有物质都充分溶解时，样品分析是最优的。
Bio-Rad色谱柱通过对以下参数的优化，可以实现其特定的应用：离子树脂的形式和柱结构。下面的表格给出了不同树脂基分析柱的对比，且提供了操作准则。表1
(见附件table 1_1 以及 table1_2)提供了柱技术说明和操作条件。表21
(见附件table 2_1 以及 table 2_2)则提供了一些树脂改良时需要的一些数据，这些数据用于柱的清洗、再生和保存。
第六部分：再生过程
6.1 松散树脂床
离子交换树脂是可以恢复原状的。平缓的反洗可以使塌陷的床层恢复到最初的结构或者使得混入的空气再次溶解。如果床层压缩太严重，柱子性能就不会回复到原始状态。
1 关掉泵 放松柱子床层大约15分钟。
2 反转流动方向，流动相以0.1ml/min的流速反洗柱子至少4小时，如果有必要，可以冲洗1晚上。
3 将柱子恢复到最初的操作条件
4 观测建议的最大流速
6.2 清洁被污染的柱子
许多由于溶剂、泵、柱入口处收集的样品中的小颗粒对柱子的污染可以通过反向冲洗柱子除去。这种方法对于由于细菌引起的污染也有效。
1 使用恰当的溶剂以0.1ml/min流速反向冲洗柱子至少4小时。
2使用合适的再生溶剂继续反向冲洗柱子约4小时。
3 恢复柱子到最初的操作条件。
如果有必要，更换末端零件。柱内的样品、离子相互作用（如碳酸钙）产生的小颗粒以及与底座强结合的化学污染物可以通过对出口堵塞的配件进行深入的清洗除去。根据步骤6.4进行出口和入口配件的拆卸。随后采用6.4中的步骤4，在纯水中对配件进行超声处理。指出的一点是当所有维修柱子的方法失败且对于复原柱子没有任何措施的时候，只能使用这种方法。
清洁或复原柱子时，为避免污染检测池，卸掉柱子和检测池之间的连接管。溶剂流过以后直接变成废液。
6.3 将主子恢复到最初的离子形式
离子交换树脂的离子形式发生变化时会收缩或膨胀。如果使用带相反电荷的缓冲溶液，柱子会变成另一种类型，从而解决背压过高的问题。大多数情况，并不全是这样，采用以下方法可以使柱子复原。
1 使用恰当的溶剂以0.1ml/min流速反向冲洗柱子至少4小时。
2 恢复柱子到最初的操作条件。
6.4 切掉拄床层
使用床层底座的情况非常少。而由于严重的高压可能会造成床层不可逆的塌陷。在柱头引起的空白空间经常需要使用Bio-Rad实验室的工具切除。为证实柱子问题是由于柱子进口处的空白引起的，分析无滞留的物质（样品），观察分析峰的托尾情况。如果不确定，咨询技术服务部：1-800-424-6723或者联系Bio-Rad当地的办公室。
1 从HPLC系统上卸下柱子
2 4℃保存柱子3小时，不要结冰
3 松掉柱子末端液体流向箭头对面，柱子入口配件上的螺母
4 使用干净的压舌板仔细将同类型、同离子形式的树脂（直接从Bio-Rad公司买来的旧柱子上的）装入柱子空白空间并压紧。树脂应压成高于柱子末端约1mm的空心圆锥体。
5 更换末端配件拧紧防泄漏的螺母。
6 恢复柱子到最初的操作条件。
6.5精馏工具、连接管路问题
很多情况下，分理效率差并不是由于柱子问题引起的，而是系统中其他硬件问题引起的。下面列出了可能出现问题的地方并提供了合理的限定值
1 注射器
样品体积： 最大100μm
回路体积： 最大500μm
2 连接管
配件没有被损坏
管末端切口是正方形
管末端是相匹配的
管直径 最大0.013’’
管长 最大10’’
3 检测器
干净的池子
池入口管最大直径0.013’’
柱子与样品的连接没有参考侧
温度恒定
第7部分
关闭热柱子
高温分离后，将流速降至0.2ml/min后再关掉加热。等柱温下降至环境温度后再停止流动相。从系统中移走热柱子后，降温时，可能会造成溶剂体积缩小，而空气会随之进入到柱子中。
如果需要迅速的更换两根柱子。热柱子可以迅速放到过滤后新鲜的去离子水中。记得拧紧末端的紧固螺母以防树脂变干。
第8部分
存放柱子
关闭柱子末端配件时应确保已将柱中的空气排净。长期存放时，柱子应该冷藏以防柱子变干。但是不能被冻住。如果柱子可能几天不用，需按照以下步骤存放。
8.1 长期存放
1使用表2中列出的储存/运输溶剂作为流动相。更换流动相的流速应该比正常流速低。
2 紧紧的封住柱子末端，用最初的螺母装备柱子。这可以使柱子中的溶剂挥发很少，从而使得树脂保持湿润状态。
3 不用时，使用最初的运输用的箱子存放柱子。为防止溶剂挥发和产生细菌，树脂柱可以在℃储存（不要冻住）。
第9部分 常见问题及解决方案
表3
(见附件table 3)是一些问题的解决方案，其中参阅了6.1-6.5列出的的再生的步骤。这些步骤在第6部分有详细的介绍。按表1、表2列出的规则操作可以使柱子的只用时间延长，任何不按规则的操作都可能就降低柱效、缩短柱子使用寿命。
色谱柱再生操作方案
鉴于色谱柱压力过高，而峰型尚可，分析可能为杂质污染，计划按下述程序进行处理
清洗程序：：
1. 用0.22的滤膜过滤流动相，反复过滤至无机械杂质为止。
2. 断开检测器与柱子的连接，以便流动相直接进入废液瓶
3. 反转柱子流动方向，控制柱温箱65℃，流动相以0.2ml/min的流速反洗柱子6小时，观察压力变化，如果有必要，可以冲洗1晚上。
4. 5%乙氰的0.005M硫酸过滤后以0.2ml/min的流速反向冲洗4小时，温度65℃。
5. 30%乙氰的0.005M硫酸过滤后以0.2ml/min的流速反向冲洗12小时，温度65℃。
再生程序：
6. 配制0.025M的硫酸流动相，过滤后以0.2ml/min的流速反向冲洗4-16小时，温度65℃。
7. 换为0.005M硫酸过滤后以0.2ml/min的流速冲洗，温度65℃。
8. 将柱子倒为正的流向，0.005M硫酸过滤后以0.2ml/min的流速继续冲洗，温度65℃。
9. 接上检测器，观察基线的情况。
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