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基因敲除中双交换问题
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大家好： 最近做一个菌的敲除，用的自杀质粒介导。单交换已经证明了质粒整合。双交换通过SceI酶切割引发重组。推测PCR检测会有三种情况，（1）仍为单交换，检测为大小两条带（2）敲除菌， 检测为小带（3）恢复到野生型，检测大带。 PCR结果发现，绝大部分为（1）情况。有少数是（2）情况。为了确认，对（2）再一次进行重复验证，又都变成了（1）的情况了。分析原因，a. SceI表达量低导致酶活不够，切割能力差。b. 可能已经出现敲除子，（2）情况的克隆不太纯。c. PCR扩增有些问题。不知道哪里的问题，向大家请教一下。在二次交换是需要注意什么，需要怎么筛选。谢谢  |
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