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mtz0305

金虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除中双交换问题

大家好:
       最近做一个菌的敲除,用的自杀质粒介导。单交换已经证明了质粒整合。双交换通过SceI酶切割引发重组。推测PCR检测会有三种情况,(1)仍为单交换,检测为大小两条带(2)敲除菌, 检测为小带(3)恢复到野生型,检测大带。 PCR结果发现,绝大部分为(1)情况。有少数是(2)情况。为了确认,对(2)再一次进行重复验证,又都变成了(1)的情况了。分析原因,a. SceI表达量低导致酶活不够,切割能力差。b. 可能已经出现敲除子,(2)情况的克隆不太纯。c. PCR扩增有些问题。不知道哪里的问题,向大家请教一下。在二次交换是需要注意什么,需要怎么筛选。谢谢
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