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紧急求助：双切的目的条带比质粒PCR得到i的带大？
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紧急求助阿 最近一直在构建克隆，用的载体是PMAL-c2x，酶切位点是EcoRI和HindIII，插入目的基因大约1600。挑重组子提质粒后分别双酶切和PCR检测，PCR的条带跟阳性对照一样，都在1600bp左右，但是双切的条带除了载体在6.6kbbp左右外，目的条带确在2kb左右，应该跟PCR的条带一样才对啊。各位虫友能给指点下子吗？问过一些人，他们说这种情况也有，可能是因为我选的酶切位点有一个是在多克隆位点的最外边。是这样吗？ [ Last edited by GinTonic on 2008-8-17 at 01:05 ] |
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reasonspare(金币+10,VIP+0):水够多，
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根据楼主提供信息进行了一下相关检索 pMAL-c2x Features: 15-46 lacI promoter 81 lacI start codon (GTG) 1161 lacI termination codon (TGA) 1205 Begin Ptac DNA fragment 1406-1433 Ptac promoter 1478 Begin malE DNA fragment 1528 malE start codon (ATG) 2587-2610 Sequence of malE primer #1237 2629 Start polylinker, factor Xa site 2735 Start lacZ-alpha sequence (CA CTG GCC) 2756-2779 complement of M13/pUC sequencing primer #1224 2901 Start rrnB terminator DNA fragment 2914 First in-frame stop codon for lacZ-alpha 3104-3307 rrnB T1T2 3327 Start pBR322 sequence 3418 beta-lactamase (Amp-r) start codon (ATG) 4276 beta-lactamase termination codon (TAA) 4320-4833 M13 origin (+ -) 4944-5532 pBR322 origin 5962 rop termination codon (TGA on complementary strand) 6151 rop start codon (GTG on complementary strand) 6646 End 多克隆位点附图 从现有信息分析，可能是插入片段这一步出现了问题 片段来源个人觉得可能是两种 1.如果目的基因1600是来自上一种载体的酶切，胶回收，再连入的pMAL-c2x， 似乎不大可能出现这样的问题，切出来还是1600，PCR也是 2.如果目的基因1600来自PCR，酶切回收（非胶回收），再连入的pMAL-c2x， 酶切出现2kb这种结果的原因可能是这样：（发挥一下想象力  ）1600片段本身在PCR过程中由于基因较长，有可能出现高级结构折叠 如果是3`端回折，则会发生自我引物效应，反向延伸导致出现比1600长的非特异性产物2kb，由于它们是非特异性产物，往往电泳时不易发现， 而此时直接用PCR产物回收试剂盒所以它们就混进来了 酶切之后，由于电泳看起来1600还是很干净，直接用试剂盒回收（非胶回收） 所以酶切好的而且可能还是混有2kb，又恰好连了进去 所以最终酶切时2kb掉了下来，而其内部 又存在楼主希望的1600片段，所以PCR有带 至于楼主提到“问过一些人，他们说这种情况也有，可能是因为我选的酶切位点有一个是在多克隆位点的最外边。” 我想看一下这张多克隆位点图谱就很显然了吧，好像没这种可能 用了太多个“可能”，因为楼主提供信息有限，若想分析清问题原因， 应当指明每一步的构建细节 请楼主指明片段来源并最好提供克隆构建时的各步电泳图谱以便大家分析 |
2楼2008-08-17 03:47:44