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pharmyang金虫 (正式写手)
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求助：SDS-PAGE 定量方法[有效期至2008.8.20]
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SDS-PAGE显色后，扫描成照片，请问有没有什么软件可以计算各个带的强度，好通过与标准品的比较估计其它带的蛋白含量。 有人说Photoshop 有计算照片上条带强度的功能，有人试过吗？ 非常感谢。 |
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zhengjun1981
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SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 蛋白质定量 1)Bradford法: 检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等. ①Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定. ②标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线. ③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS) ④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去. ⑤每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟. ⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度. 2)Lowry法: 检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测. ①首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上. ②Folin-ciocalteu酚试剂 ③按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A ④按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B ⑤用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5μg /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白. ⑥每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟. ⑦加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟. ⑧在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度. 3)紫外分光光度法: 检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在. ①纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值. ②对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml 蛋白质 A280(1mg/ml) IgG 1.35 IgM 1.2 BSA 0.7 ③含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定: 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260) 蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205) |
2楼2008-08-15 08:22:35
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