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xyz19881005

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问平衡Ni柱的缓冲液用什么比较好? 已有3人参与

之前一直用Tris来平衡Ni柱至碱性,今天看见有人说用磷酸盐溶液平衡效果会更好,请问各位谁用过?具体配方是什么?万分感激
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
Tris也用过,PBS也用过,感觉没那么大影响,还是得看蛋白适合什么buffer
2楼2015-08-03 16:25:31
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xyz19881005

新虫 (初入文坛)

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2楼: Originally posted by a86052 at 2015-08-03 16:25:31
Tris也用过,PBS也用过,感觉没那么大影响,还是得看蛋白适合什么buffer

目前有杂带总是去除不掉,试图在buffer上做改进,不同的蛋白适合不同的buffer?如何确定?
3楼2015-08-03 16:33:43
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a86052

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xyz19881005 at 2015-08-03 16:33:43
目前有杂带总是去除不掉,试图在buffer上做改进,不同的蛋白适合不同的buffer?如何确定?...

杂带你可以拉梯度洗杂试试,也许略微高点的咪唑能将其洗掉,后续的纯化 呢,单一的Ni柱不一定 能达到目的的
4楼2015-08-03 17:00:29
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xyz19881005

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-08-03 17:00:29
杂带你可以拉梯度洗杂试试,也许略微高点的咪唑能将其洗掉,后续的纯化 呢,单一的Ni柱不一定 能达到目的的...

目前做的梯度10mM  25mM  40mM  60mM  100mM   300mM  结合缓冲液从10mM降低到5mM了 因为有两个蛋白结合力较弱  

感觉梯度已经够细了 可能确实单一的纯化方法很难得到满意的结果  老师说可以再过个分子筛   但是分子筛的时间慢  而且又会有部分蛋白损失掉   

请问buffer的配方上还有没有改进的地方了?一点点改进也好i
5楼2015-08-03 17:15:27
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a86052

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by xyz19881005 at 2015-08-03 17:15:27
目前做的梯度10mM  25mM  40mM  60mM  100mM   300mM  结合缓冲液从10mM降低到5mM了 因为有两个蛋白结合力较弱  

感觉梯度已经够细了 可能确实单一的纯化方法很难得到满意的结果  老师说可以再过个分子筛   但是 ...

这个个人觉得还是过离子或者分子筛纯化下更靠谱
6楼2015-08-03 17:29:39
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sy0714541

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

过分子筛,不用换buffer,分子筛也就两三个小时的问题!收集的时候,多分几管收集
浦东新区从事生物医药研发,小硕一枚
7楼2015-08-07 15:01:57
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树在田野

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

PBS缓冲液在某些情况下确实结合效率比较好,但有时候介质不同效果也会有差别,如果洗脱仍有杂蛋白建议样品及缓冲液可加5-10mM咪唑,增加纯度。前提是目的蛋白表达量较高。祝顺利!
好好学习
8楼2015-08-09 21:59:09
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