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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 请问平衡Ni柱的缓冲液用什么比较好？
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xyz19881005

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问平衡Ni柱的缓冲液用什么比较好？ 已有3人参与

之前一直用Tris来平衡Ni柱至碱性，今天看见有人说用磷酸盐溶液平衡效果会更好，请问各位谁用过？具体配方是什么？万分感激
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1楼 2015-08-03 15:20:19
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Tris也用过，PBS也用过，感觉没那么大影响，还是得看蛋白适合什么buffer
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2楼2015-08-03 16:25:31
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xyz19881005

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-08-03 16:25:31
Tris也用过，PBS也用过，感觉没那么大影响，还是得看蛋白适合什么buffer

目前有杂带总是去除不掉，试图在buffer上做改进，不同的蛋白适合不同的buffer？如何确定？
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3楼2015-08-03 16:33:43
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xyz19881005 at 2015-08-03 16:33:43
目前有杂带总是去除不掉，试图在buffer上做改进，不同的蛋白适合不同的buffer？如何确定？...

杂带你可以拉梯度洗杂试试，也许略微高点的咪唑能将其洗掉，后续的纯化 呢，单一的Ni柱不一定 能达到目的的
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4楼2015-08-03 17:00:29
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xyz19881005

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-08-03 17:00:29
杂带你可以拉梯度洗杂试试，也许略微高点的咪唑能将其洗掉，后续的纯化 呢，单一的Ni柱不一定 能达到目的的...

目前做的梯度10mM  25mM  40mM  60mM  100mM   300mM  结合缓冲液从10mM降低到5mM了 因为有两个蛋白结合力较弱  

感觉梯度已经够细了 可能确实单一的纯化方法很难得到满意的结果  老师说可以再过个分子筛   但是分子筛的时间慢  而且又会有部分蛋白损失掉   

请问buffer的配方上还有没有改进的地方了？一点点改进也好i
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5楼2015-08-03 17:15:27
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xyz19881005 at 2015-08-03 17:15:27
目前做的梯度10mM  25mM  40mM  60mM  100mM   300mM  结合缓冲液从10mM降低到5mM了 因为有两个蛋白结合力较弱  

感觉梯度已经够细了 可能确实单一的纯化方法很难得到满意的结果  老师说可以再过个分子筛   但是 ...

这个个人觉得还是过离子或者分子筛纯化下更靠谱
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6楼2015-08-03 17:29:39
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sy0714541

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

过分子筛，不用换buffer，分子筛也就两三个小时的问题！收集的时候，多分几管收集
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浦东新区从事生物医药研发，小硕一枚
7楼2015-08-07 15:01:57
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树在田野

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

PBS缓冲液在某些情况下确实结合效率比较好，但有时候介质不同效果也会有差别，如果洗脱仍有杂蛋白建议样品及缓冲液可加5-10mM咪唑，增加纯度。前提是目的蛋白表达量较高。祝顺利！
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好好学习
8楼2015-08-09 21:59:09
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