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alfred111至尊木虫 (著名写手)
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[交流]
酵母染色质的提取方法
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哪位大虾能告诉俺酵母染色质的提取方法阿？谢谢啦 还有其中用到的磷酸钾缓冲液的浓度是0.5M还是0.05M？ PH=7.5 小妹急用阿 |
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wjswj
木虫 (正式写手)
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2楼2008-08-13 15:02:14
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reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
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酵母总DNA提取常规NACL方法： 1. 1分钟收集菌体，沉淀悬浮在破菌400微升BUFFER，加入3 0μl 10mg/ml溶菌酶，同时加1微升1mg/ml的RNA酶； 2. 37℃ 孵育1hour； 3. 60度水浴30分钟，不间断，用枪头激烈吹打破碎细胞； 4. 加入200微升5M NACL，混匀，12000离心10分钟； 5. 取上清，转入到另外的EP管中，加入等体积的氯仿，剧烈摇匀； 6. 12000离心10分钟，将上层水相转入到另一个EP管中； 7. 2v体积无水乙醇沉淀，-20度放置10-20分钟； 8. 12000离心10分钟，弃上清； 9. 70%乙醇洗涤，离心10分钟，烘干，TE溶解。 BUFFER: 100ml 100mM TRIS-HCL PH 8.0 5mM EDTA PH 8.0 500mM NACL 1.25% SDS 1M 巯基乙醇 16微升 酵母基因组的提取方法（改良）： 1. 接种酵母到2.5ml 酵母试管培养基中(YPD 培养基)，30℃，培养16～18h；取1.5ml 酵母培养液，室温下，1500 × g 离心5～10min 收集菌体；菌体用灭菌水洗1 次，1500 ×g离心5min； 2. 菌体用200μl SCED(1mol/L 山梨醇、10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT二硫苏糖醇)溶液重悬，加入3 0μl 10mg/ml 溶菌酶(Lysozyme)37℃温浴1h； 3. 加入100μl 2%SDS 混匀，－ 20℃冰冻，然后室温震荡溶解，反复3 次； 4. 向悬浮液中加入150μl 5mol/L KAc(pH 8.9)轻轻混匀，然后10000r/min离心5min； 5. 将上清转移到一新的1.5ml 离心管中，加入2 倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5min 后12000r/min离心10min； 6. 除去上清，将沉淀溶解在300μl TE(10mmol/LTris-HCl，pH7.4，1mmol/L EDTA，pH8.0) 中， 7. 加入6μl RNase (10mg/ml)，37℃温浴30min；加入饱和酚和氯仿各150μl 充分混匀，然后10000r/min 离心5min； 8. 转移上清到新的1.5ml 离心管中，加入1/2体积的7.5mol/L NH4Ac(pH7.5)和等体积的异丙醇，－ 20℃放置20min 后12000r/min 离心10min 9. 除去上清，加入300μl 70% 乙醇漂洗沉淀一次，10000r/min 离心5min； 10. 风干除去乙醇，用2 0μl TE 溶解酵母DNA。 |
3楼2008-08-13 19:35:19
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